[發明專利]一種含自體基質細胞的生物美容制劑

有效

• 申請號: 201410363877.7
• 申請日: 2014-07-29
• 公開（公告）號: CN104173252B
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 蔡賢芬
• 申請（專利權）人: 蔡賢芬
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A61K8/98;A61K8/9771;A61K8/64;A61K8/66;A61Q19/08;A61P17/02;A61P17/10
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1.一種含自體基質細胞的生物美容制劑的制備方法，其中，所述方法為通過從自體外周血中獲取自體血漿和自體基質細胞，將自體基質細胞加入到自體血漿中制備成生物美容制劑，并添加了生長因子和抗氧化因子；

所述自體基質細胞由離心獲取自體血漿后的30-35ml血細胞，經淋巴分離液密度梯度離心獲得單個核細胞，用基質細胞無血清完全培養基重懸，按1-3×10⁶細胞/ml加入到75cm²培養瓶中15ml，于37℃，5％CO₂培養箱中生長48小時；其中，所述基質細胞無血清完全培養基含10％無血清營養添加物和10-20ng/ml重組人堿性成纖維細胞生長因子；

48小時后對培養基質細胞換液，用10ml移液管吸棄培養液，加入10ml新鮮的基質細胞無血清完全培養基，75cm²培養瓶繼續放置37℃，5％CO₂培養箱中生長72小時；

72小時后基質細胞在75cm²培養瓶中生長融合達到80％以上，用10ml移液管吸棄培養液，取5ml 1×PBS洗滌1次培養瓶底，加入2ml質量體積比為0.25％的胰酶到培養瓶中，放置37℃，5％CO₂培養箱中消化2-3分鐘；消化后加入200微升胎牛血清終止消化，再加入5ml生理鹽水，用10ml移液管吹打，吸至50ml離心管中，用5ml的生理鹽水洗滌一次，同樣加入到50ml離心管中，1200轉每分鐘離心5分鐘收集基質細胞；

離心后用1ml基質細胞無血清完全培養基重懸，進行細胞傳代培養，即1瓶75cm²培養瓶的細胞擴至2瓶75cm²培養瓶中進行培養，每瓶加入15ml基質細胞無血清完全培養基，于37℃，5％CO₂培養箱中生長48小時后換液，繼續培養72小時后基質細胞生長融合達到80％以上，繼續傳代培養3代；

傳代培養3代后用胰酶進行消化并用生理鹽水洗滌2次，計數后即獲得基質細胞，放置冰箱4℃存放備用；另外部分基質細胞將加入凍存液，將1ml 6×10⁶細胞/ml基質細胞放入凍存管中凍存；

所述自體基質細胞加入鼠抗人SDF1單克隆抗體和兔抗鼠IgG1-PE，染色后經流式細胞儀檢測基質細胞高表達，SDF1陽性率大于80％以上；

所述制備方法中添加的生長因子僅為表皮生長因子、堿性成纖維生長因子和角蛋白18中的一種以上；所述制備方法中添加的抗氧化分子僅為超氧化歧化酶、胎盤提取精華素和銀杏葉提取液中的一種以上。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述自體血漿由抽取人自體60ml EDTA抗凝外周血，經1500轉每分鐘速度離心10分鐘，獲得的25-30ml自體血漿，放置冰箱4℃存放備用。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述基質細胞無血清完全培養基含10％無血清營養添加物和10-20ng/ml重組人堿性成纖維細胞生長因子。

4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述胰酶含質量體積比為0.01％的EDTA。

5.一種含自體基質細胞的生物美容制劑，其中，該制劑主要由如下成分組成：

1)5ml自體血漿；

2)1ml 6×10⁶細胞/ml權利要求1-4任一項中所述的自體基質細胞；

3)200ng/ml生長因子和抗氧化分子；

裝入10ml無菌的塑料針管中，共6ml，用蓋子密封包裝，形成生物美容制劑；

該生物美容制劑保存在4℃條件下，保質期為48小時；

所述生長因子為表皮生長因子、堿性成纖維生長因子和角蛋白18中的一種以上；所述抗氧化分子為超氧化歧化酶、胎盤提取精華素和銀杏葉提取液中一種以上。

6.一種根據權利要求1-4任一項所述方法制備的生物美容制劑。