[發明專利]一種粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶基因及其應用

在審

• 申請號: 201410362681.6
• 申請日: 2014-07-28
• 公開（公告）號: CN104131017A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 周哲敏;朱龍寶;崔文璟;周麗
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N9/88;C12N15/10;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/22;C12P7/40;C12R1/645
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一種粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶基因及其應用，屬于生物技術領域。

背景技術

苯丙氨酸脫氨酶(PAL)在pH8.0時催化L-苯丙氨酸(L-phe)脫氨生成反式肉桂酸和氨，pH11.0時能催化逆向反應合成L-phe，工業上利用這一特性，生產人體必須氨基酸L-phe和甜味劑阿斯巴甜。PAL廣泛存在于植物、微生物中，微生物主要有霉菌和酵母菌，尤其是紅酵母屬中。其中粘紅酵母(Rhodotorula?glutinis)可以在廉價的原料如玉米粉，糖漿，糖蜜，豆粕，味精廢水等工業廢料上生長，容易實現大規模的培養，已經成功應用于食品、制藥等工業領域。但是由于該酶是誘導酶，在對數生長期酶活達到峰值后，酶活下降較快，穩定性差。

為進一步提高酶活和穩定性，需要采用分子生物手段對酶進行分子改造，但到目前為止，僅僅獲得PAL的部分cDNA，缺少5'端的基因序列。由于該基因的5'端序列的GC含量高，容易形成發夾結構，傳統的反轉錄很難成功。

為此，本發明提供了一種粘紅酵母PAL全長的基因序列，經表達，獲得4.2U/mg?PAL。

發明內容

本發明的目的是提供一種粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

所述苯丙氨酸脫氨酶基因是以工業生產用菌株粘紅酵母為出發菌株，分離其總RNA，反轉錄獲得苯丙氨酸脫氨酶的cDNA，最終獲得全長為2121bp的基因序列，編碼706個氨基酸，酶活達到4.2U/mg，是目前已報到的最高酶活。

苯丙氨酸脫氨酶基因編碼的苯丙氨酸脫氨酶可用于催化生產L-苯丙氨酸或反式肉桂酸。

本發明要解決的第二個技術問題是提供一種表達所述苯丙氨酸脫氨酶的基因工程菌。優選以大腸桿菌為宿主，以pET-22b(+)、pET-23(+)、pET-28a(+)或pET-20b(+)為表達載體。進一步優選將獲得的基因與載體pET-28a(+)連接，構建重組表達載體pET-28a(+)-pal，轉化E.coli?BL21。

本發明要解決的第三個技術問題是提供一種表達所述基因獲得苯丙氨酸脫氨酶的方法。優選以大腸桿菌為宿主，以pET-22b(+)、pET-23(+)、pET-28a(+)或pET-20b(+)為表達載體。進一步優選將獲得的基因與載體pET-28a(+)連接，構建重組表達載體pET-28a(+)-pal，轉化E.coli?BL21后誘導表達該基因。

所述方法進一步優選將帶有pET-28-pal的重組大腸桿菌培養至OD₆₀₀為0.6時加入誘導劑IPTG至終濃度0.4mM，于24℃培養12h后離心收集菌體，用含有10mM的咪唑、150mM氯化鈉，pH7.5的50mM的磷酸緩沖液洗滌2次，然后采用超聲破碎細胞30min后離心收集上清，上清用帶有His標簽的親和層析柱純化，用含250mM咪唑、150mM?NaC，pH7.5的磷酸緩沖液進行洗脫，收集目的蛋白。將收集的目的蛋白用脫鹽柱脫鹽得到純化后的PAL。

本發明提供了一種完整的新的粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶基因，編碼的苯丙氨酸脫氨酶酶活達到4.2U/mg，是目前已報到的最高酶活。該基因的獲得為進一步利用分子生物學手段對酶進行改造，以提高酶活及其穩定性提供了基礎。所得苯丙氨酸脫氨酶及相應基因工程菌都可以應用于生產L-苯丙氨酸或反式肉桂酸。

附圖說明

圖1為粘紅酵母總RNA的電泳圖。

圖2為反轉錄后PCR擴增全長基因的電泳圖。

圖3為粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶的閱讀框及翻譯的氨基酸序列。

圖4為重組酶的表達；M，蛋白marker；1，不帶重組質粒pET-28-pal的E.coil?BL21全細胞電泳；2，帶重組質粒pET-28-pal，未用IPTG誘導的E.coil?BL21全細胞電泳；3，帶重組質粒pET-28-pal，IPTG誘導的E.coil?BL21全細胞電泳。

圖5SDS-PAGE檢測純化的蛋白；M，為蛋白marker；1，全細胞電泳；2，采用His純化柱純化后獲得的PAL。

圖60.5mM反式肉桂酸標樣的HPLC圖(出峰時間為6.35min)。

圖7重組酶催化L-苯丙氨酸后HPLC分析(在6.25min出現產物峰，與標樣出峰時間一致)。

具體實施方式

實施例1?提取粘紅酵母總RNA