[發明專利]鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽及其應用

有效

• 申請號: 201410361073.3
• 申請日: 2014-07-25
• 公開（公告）號: CN104193805B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發明（設計）人: 王臣;李小康;郭香玲;汪洋;牛明媚;吳庭才
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;A61K38/10;A61P31/14;A61P35/00;A23K20/147
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司41119
• 代理人: 牛愛周

技術領域

本發明涉及一種鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽，同時還涉及該抑制肽的應用，屬于動物病毒分子生物學技術領域。?

背景技術

近年來，中國南方爆發了一種新的鴨病毒性傳染病，主要引起鴨產蛋嚴重下降，該病傳播迅速、涉及范圍廣，發病前期為持續高熱，發病后期出現一定比例的神經癥狀，表現為癱瘓、翻滾、站立不穩及共濟失調等，有些病鴨甚至在數日內死亡。剖檢死亡鴨，多數呈現脾臟和腎臟明顯腫大，蛋鴨表現為出血性卵巢炎。該病首先在江浙一帶爆發，隨后蔓延到福建和安徽等地，之后在江西、山東、湖南、河南、河北相繼爆發。對于此病，國外尚未見報道。國內研究人員對其病原進行了分離、形態學觀察、理化特性測定、RT-PCR檢測及序列分析，現已確定該病病原為鴨坦布蘇病毒，故稱該病為鴨坦布蘇病毒病。該病發病率高、傳播迅速，發病范圍極廣，已給養鴨業造成重大經濟損失。?

鴨坦布蘇病毒(Duck?tembusu?virus，DTMUV)是一種新型黃病毒，屬于黃病毒科不分節段的單股正鏈RNA病毒，其病毒粒子呈球形，直徑約45～50?nm，有囊膜和纖突，病毒約由10990個核苷酸組成。該病毒對熱、脂溶劑和去氧膽酸鈉敏感，pH<5或pH>10時便失去感染活性，50℃以上加熱60?min即被滅活。DTMUV能在鴨胚、雞胚、鴨胚成纖維細胞及Vero、BHK、C6/36等部分傳代細胞系上增殖。其病毒基因組由5’端、3’端的非編碼區和中間的一個開放閱讀框組成，5’端的非編碼區長度為142?nt，含I型m7GpppNp帽子結構，3’端非編碼區長618?nt，沒有poly(A)尾巴，開放閱讀框編碼由3410個氨基酸殘基構成的多聚蛋白前體。前體蛋白在宿主信號肽酶和病毒絲氨酸蛋白酶的作用下被切割成3種結構蛋白(C、prM和E)和7種非結構蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。?

E蛋白是一種囊膜蛋白，編碼501個氨基酸，其氨基酸序列中存在高度保守區和變異區。E蛋白位于成熟病毒顆粒表面，在病毒吸附受體、與宿主細胞膜融合以及病毒組裝過程中具有重要的作用，且含有多種抗原表位，這些表位與病毒識別宿主細胞膜受體、吸附和進入細胞，病毒的致病性和誘導免疫應答等密切相關，在病毒感染中起重要作用。另外，E蛋白還具有較好的免疫原性和反應原性，是宿主抗感染免疫的主要保護性抗原，也是檢?測該病毒特異性抗體的理想靶抗原。?

噬菌體展示技術是近年來興起的一項研究蛋白質分子間相互作用的有效手段，具有快捷、高效、表型和基因型一致等特點，近年來被廣泛應用于肽類藥物、抑制肽、抗原模擬表位的篩選等研究領域。利用噬菌體展示技術篩選鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽，并研究該抑制肽對DTMUV在鴨胚成纖維細胞增殖方面的影響，可為鴨坦布蘇病毒病防治提供一個新的途徑，具有較好的應用前景。?

發明內容

本發明的目的是提供一種鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽。?

同時，本發明還提供一種鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽的應用。?

為了實現以上目的，本發明所采用的技術方案是：?

鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。?

所述的鴨坦布蘇病毒為鴨坦布蘇病毒HN1株。?

鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽的應用，具體為鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽在制備抗鴨坦布蘇病毒病(抑制鴨坦布蘇病毒增殖，如抑制鴨坦布蘇病毒在鴨胚成纖維細胞增殖)的藥物或飼料添加劑中的應用。?

本發明的有益效果：?

本發明通過基因工程方法獲得DTMUV?HN1株E蛋白，并以DTMUV?HN1株E蛋白作為靶標，利用噬菌體隨機12肽庫篩選得到鴨坦布蘇病毒囊膜E蛋白抑制肽，其氨基酸序列為：HWSTRQGSTRWN。該抑制肽可抑制鴨坦布蘇病毒HN1株在鴨胚成纖維細胞的增殖。標準MTT法檢測E蛋白抑制肽對鴨胚成纖維細胞增殖的影響，結果顯示，E蛋白抑制肽本身對鴨胚成纖維細胞的增殖無明顯影響。熒光定量PCR和TCID50檢測E蛋白抑制肽對DTMUV在鴨胚成纖維細胞增殖方面的影響，結果顯示，不同濃度的的抑制肽(0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL)均能顯著下調DTMUV在鴨胚成纖維細胞中的病毒拷貝數，同時顯著降低DTMUV在鴨胚成纖維細胞中的病毒滴度。結果表明，囊膜E蛋白抑制肽能抑制DTMUV在鴨胚成纖維細胞的增殖，在DTMUV的防治中具有良好的應用前景。?

附圖說明