[發(fā)明專利]一種Δ6-脂肪酸脫氫酶基因及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410360120.2
• 申請日: 2014-07-28
• 公開（公告）號: CN104250650A
• 公開（公告）日: 2014-12-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張琦;楊曉霞;魏云林;林連兵;季秀玲
• 申請（專利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12P7/64;C12R1/19;C12R1/865
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域和遺傳工程領(lǐng)域，涉及從一種絲狀真菌---毛霉屬的深黃被孢霉（Mortierella?isabellina）M6-22中克隆的Δ⁶-脂肪酸脫氫酶基因，并將該基因直接與不同載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌、酵母、植物或動物中，利用其編碼Δ⁶-脂肪酸脫氫酶產(chǎn)生包括γ-亞麻酸等多不飽和脂肪酸。

背景技術(shù)

γ-亞麻酸（γ-linolenic?acid）是一種多功能油脂成分，是人體必需的多不飽和脂肪酸，具有多種重要的生理活性作用，在機(jī)體的生理調(diào)控和物質(zhì)代謝上發(fā)揮著重要的作用，如降血脂、抗血栓性心腦血管、預(yù)防和治療高血壓、動脈粥樣硬化，增強(qiáng)人體的免疫功能，還具有抗腫瘤、抗脂質(zhì)過氧化、抑制潰瘍和增強(qiáng)胰島素和減肥等方面的作用[董杰明等，2003，衛(wèi)生研究,32(3):299-301]。尤其是在糖尿病、心血管疾病及癌癥方面的醫(yī)療價值，γ-亞麻酸已成為學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)。

Δ⁶-脂肪酸脫氫酶能特異性催化亞油酸(linoleic?acid,?C18:2Δ^9,12)和α-亞麻酸?(α-linolenic?acid,?C18:3Δ^9,12,15)?羧基端的第6和第7位碳原子之間插入一個新的雙鍵，分別脫氫形成?γ-亞麻酸?（γ-linolenic?acid,?C18:3Δ^6,9,12）和十八碳四烯酸?(stearidonic?acid,?C18:4Δ^6,9,12,15)，它們再通過碳鏈延伸和脫氫進(jìn)一步形成其它長鏈的多不飽和脂肪酸（long-chain?polyunsaturated?fatty?acid,?LC-PUFAs），因此Δ⁶-脂肪酸脫氫酶是人和哺乳動物體內(nèi)合成長鏈多不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶。這些長鏈多不飽和脂肪酸是機(jī)體組織生物膜組成成分，起到維持細(xì)胞正常功能和增加機(jī)體抗逆性的作用[Napier?JA?et?al，1999，Curr.Opin.Plant?Biol，2:123-127]，同時也是前列腺素、環(huán)前列腺素和白三烯類等具有強(qiáng)烈生理活性的自身調(diào)節(jié)物的前體[Horrobinn?DF,1992,Prog?Lipid?Res.,31:163-194]。Δ⁶-脂肪酸脫氫酶活性的降低將導(dǎo)致γ-亞麻酸的合成量減少，引起人體的各種機(jī)能紊亂，進(jìn)而引發(fā)各種疾病。因此，從不同生物體中克隆Δ⁶-脂肪酸脫氫酶基因，再與不同表達(dá)載體連接后轉(zhuǎn)入不同的宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，利用宿主產(chǎn)生γ-亞麻酸和其他長鏈多不飽和脂肪酸具有極大應(yīng)用前景。

由于人們越來越認(rèn)識到γ-亞麻酸和其他長鏈多不飽和脂肪酸的重要性，因此將注意力又轉(zhuǎn)向?qū)Ζ?sup>6-脂肪酸脫氫酶的研究上。Δ⁶-脂肪酸脫氫酶屬于一類膜整合酶，由于分離和鑒定膜結(jié)合蛋白的難度很大[MaKeon，1981，酶學(xué)方法，12141-12147；wang等，1988，植物生理學(xué)生物化學(xué)，26:777-792]，因此常規(guī)的生物化學(xué)方法很難得到包括Δ⁶-脂肪酸脫氫酶在內(nèi)的各種膜結(jié)合蛋白性質(zhì)脫氫酶高級機(jī)構(gòu)，而只能通過對酶的核苷酸序列進(jìn)行初步研究，對于Δ⁶-脂肪酸脫氫酶的生物學(xué)功能驗證，許多實驗室采用了從各種生物體中克隆相關(guān)的基因并轉(zhuǎn)入各種受體細(xì)胞中，然后在受體細(xì)胞中觀察其脂肪酸改變的方法。序列對比的結(jié)果表明，編碼Δ⁶-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列具有共同的機(jī)構(gòu)特性：存在三個組氨酸保守區(qū)，形成四次跨膜的結(jié)構(gòu)[Kyte?et?al，1982，J.Mol.Biol.157:105-132]，此外，除了藍(lán)細(xì)菌外，真核生物的Δ⁶-脂肪酸脫氫酶的氨基端都含有類似于細(xì)胞色素b5(Cytb5)血紅素結(jié)合區(qū)（HPGG）[Napier?JA,Sayanova?O,Stobart?AK,et?al.,1997,Biochem.J.,157:105-132]，這些都是維持脫氫酶活性所必須的。