[發(fā)明專利]蠟狀芽孢桿菌ZJB-11071及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410359149.9
• 申請日: 2014-07-25
• 公開（公告）號: CN104232508A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 柳志強(qiáng);鄭裕國;高愛存;薛亞平;薛峰;萬南微
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P17/02;C12P13/00;C12R1/085
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一株產(chǎn)脫鹵酶的菌株——蠟狀芽孢桿菌(Bacillus?cereus)ZJB-11071，及其在生物催化合成環(huán)氧化物和手性藥物中間體中的應(yīng)用。

(二)背景技術(shù)

1948年Heppel等首先描述了由微生物產(chǎn)生的能使二氯甲烷水解成甲醛的脫鹵酶，此后不同類型的脫鹵酶被相繼發(fā)現(xiàn)。1960年Janssen把能從鹵族有機(jī)化合物上使鹵族離子釋放出來的酶統(tǒng)稱作脫鹵酶(Dehalogenase)。從1968年Castro等首次發(fā)現(xiàn)以2,3-二溴丙醇作為唯一碳源而生存的黃桿菌(Flavobaterium?sp.)菌株至今，人們相繼篩選到多種可以降解鹵代醇的微生物。其中包括從淡水沉淀物中分離的放射形土壤桿菌(Agrobacterium?radiobacter)AD1和節(jié)桿菌(Arthrobacter?sp.)AD2以及從土壤中獲得的棒狀桿菌(Corynebacterium?sp.)N-1074等。雖然它們降解有機(jī)鹵化物的途徑雖然存在明顯差異，但是鹵代醇脫鹵酶作為關(guān)鍵酶之一，催化碳鹵鍵的斷裂存在于所有的代謝途徑中。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種能夠產(chǎn)生鹵醇脫鹵酶的菌株——蠟狀芽孢桿菌(Bacillus?cereus)ZJB-11071，及其在生物催化合成環(huán)氧化物和手性藥物中間體中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

蠟狀芽孢桿菌(Bacillus?cereus)ZJB-11071，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國.武漢.武漢大學(xué)，430072，保藏編號CCTCC?No：M2013314，保藏日期2013年7月5日。該菌株由浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所從土壤中分離獲得，經(jīng)檢測具有催化合成環(huán)氧化物和手性藥物中間體(R(-)4-氰基-3-羥基丁酸乙酯)的性能。

本發(fā)明還涉及所述的蠟狀芽孢桿菌ZJB-11071在微生物催化鹵代醇制備環(huán)氧化物中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為：以蠟狀芽孢桿菌ZJB-11071經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的濕菌體為催化劑，以鹵代醇為底物，于pH值為7.0～7.5的緩沖液中，在35℃、150rpm條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，離心，取上層有機(jī)相即為含有環(huán)氧化物的混合液，將混合液分離純化，獲得所述環(huán)氧化物。

所述催化劑的用量以濕菌體質(zhì)量計，終濃度為30～80g/L，優(yōu)選50g/L，所述底物的初始濃度為20～50mmol/L。

所述鹵代醇為1,3-二氯-2-丙醇、2,3-二氯-2-丙醇或1,3-二溴-2-丙醇。

本發(fā)明還涉及所述的蠟狀芽孢桿菌ZJB-11071在生物催化合成手性藥物中間體中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為：以蠟狀芽孢桿菌ZJB-11071經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的濕菌體為催化劑，以S(-)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯為底物，于pH值為7.0～7.5的緩沖液中，在35℃下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，離心，取上層有機(jī)相，將混合液分離純化，獲得R(-)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯；所述催化劑的用量以濕菌體質(zhì)量計，終濃度為50g/L，所述底物的初始濃度為20～50mmol/L。

本發(fā)明所述濕菌體按如下方法制備：

(1)斜面培養(yǎng)

將蠟狀芽孢桿菌ZJB-11071接種至斜面培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)12h，獲得斜面菌體；

所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：NaCl10.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，瓊脂20.0g/L，溶劑為水，pH值為7.0；

(2)種子培養(yǎng)

從斜面菌體挑取一接種環(huán)菌體接種至種子培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)24h，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：NaCl10.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，溶劑為水，pH值為7.0；

(3)發(fā)酵培養(yǎng)

將種子液以體積濃度1％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，150rpm振蕩培養(yǎng)60h后，在12000g下離心5min，收集濕菌體；