[發明專利]一種多基因轉染腫瘤細胞株及其融合瘤苗和制備方法

無效

• 申請號: 201410356991.7
• 申請日: 2014-07-24
• 公開（公告）號: CN104099297A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發明（設計）人: 周國雄;黃莉莉
• 申請（專利權）人: 南通大學附屬醫院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;A61K39/00;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 徐激波

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及一種多基因轉染腫瘤細胞株及其融合瘤苗和制備方法。

背景技術

在腫瘤免疫過程中，T細胞的免疫功能起關鍵作用。特別是與調節性T細胞(reguLatory?T?cell，Treg)的免疫抑制性作用有密切的關系，因此清除患者體內的Treg有望改善患者的免疫功能。但最近的研究發現，清除癌癥患者體內Treg后Treg水平會很快恢復并容易引起自身免疫疾病，因而靶向Treg的腫瘤治療策略應從“清除(depletion)”轉變為“抑制(inhibition)”，即抑制體內Treg的數量和功能。目前，Foxp3是目前公認的Treg細胞的最敏感的標志。Foxp3作為在胸腺中表達的自身抗原，其mRNA轉染樹突狀細胞(Dendritic?cell，DC)以后形成的接種疫苗有能力刺激Foxp3特異性的CTL，引起Treg的抑制和抗腫瘤免疫的加強，最重要的是，Foxp3疫苗優先導致腫瘤組織中表達Foxp3的Treg的抑制而不是抑制外周血中Treg，以及對Treg抑制的延長，降低了自身免疫反應的危險。Michael等人將過表達的Foxp3轉入DC后，可以通過DC細胞激活T細胞，調節APC反應，過表達Foxp3的DC能夠在體外明顯抑制Treg細胞以及CD8⁺T細胞的增殖。鋅指蛋白A20沉默的樹突狀細胞顯示出自發的、增強的共刺激分子和促炎癥因子的表達，而對于T細胞亞型則有著不同的效果—它抑制Treg并強烈激活腫瘤浸潤性細胞毒T淋巴細胞和產生IL-6和TNF-α的輔助性T細胞，是一個難以抗拒的Treg調節的抑制物。樹突狀細胞和腫瘤細胞融合，可以獲得既有DC特殊功能又表達腫瘤抗原的雜合體，但是DC攝取腫瘤抗原誘導免疫激活還是抑制，取決于腫瘤細胞釋放危險信號(GM-CSF、MCP1及熱休克蛋白等)還是抑制性信號(TGF-β₁、IDO和iNOS等)。在危險信號的調節下，激活Th1細胞免疫應答清除腫瘤；而在抑制性信號的作用下，激活Th2應答，不能有效清除腫瘤。美國華盛頓大學醫學中心實驗發現，在人胰腺癌及小鼠胰腺癌模型(Pan02),腫瘤細胞的產物可引起CCR5趨化因子受體配體的增加，同時，與CD4⁺Foxp3^-效應T細胞相比，CD4⁺Foxp3⁺Tregs更優先表達CCR5，通過減少腫瘤細胞產物CCL5，或者通過給予CCR5抑制劑，則CCR5/CCL5信號被打破，Treg向腫瘤的聚集減少，而小鼠對照組的腫瘤細胞也變小了，因此，這項研究表明，通過阻斷Treg向腫瘤的聚集，可能能解決免疫逃避的問題，與DC疫苗聯合應用能更好的治療胰腺癌。基因修飾的樹突狀細胞融合疫苗是指以基因工程的方法將一些釋放危險信號或者阻斷抑制信號的細胞因子(如IL-12和TGF-β₁)或者調節功能相關基因(如A20和Foxp3)導入腫瘤細胞(或DC細胞)后再與DC(或者腫瘤細胞)進行融合，融合細胞能持續分泌這些細胞因子，比單純的融合疫苗更為有效。近來腫瘤疫苗已發展成為一種重要的腫瘤生物治療手段。與手術治療、放射治療相比，毒副作用小，特異性高，作用范圍更廣泛。在腫瘤治療研究中越來越引起重視。目前針對各種腫瘤而設計了多種的轉基因瘤苗，如將各種細胞因子轉染相關的腫瘤細胞以改善腫瘤細胞的遺傳背景，提高免疫原性，誘導更強的免疫應答。

發明內容

發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的在于提供一種多基因轉染腫瘤細胞株，構建過表達Foxp3和A20miRNA修飾Treg的DSL6A/C1細胞。本發明的另一目的是提供一種融合瘤苗，獲得既有DC特殊功能又表達腫瘤抗原的新型腫瘤疫苗。本發明還有一目的是提供一種上述多基因轉染腫瘤細胞株的制備方法。本發明還有一目的是提供一種上述融合瘤苗的制備方法。

技術方案：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

一種多基因轉染腫瘤細胞株，負載過表達Foxp3質粒和A20miRNA質粒，所用轉染細胞為大鼠胰腺癌腫瘤細胞系DSL6A/C1。

一種多基因轉染腫瘤細胞株的制備方法：構建負載過表達Foxp3質粒和A20miRNA質粒，采用慢病毒法共轉染到DSL6A/C1細胞，抗生素篩選穩轉細胞株。

一種融合瘤苗，為所述的多基因轉染細胞株與樹突狀細胞的融合疫苗，既有DC特殊功能又表達腫瘤抗原。