[發明專利]鹽酸賽庚啶的免疫膠體金檢測卡及其制備方法

在審

• 申請號: 201410356401.0
• 申請日: 2014-07-25
• 公開（公告）號: CN105277706A
• 公開（公告）日: 2016-01-27
• 發明（設計）人: 洪霞;薛永來
• 申請（專利權）人: 江蘇維賽科技生物發展有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及動物源食品添加劑檢測技術領域，特別是涉及鹽酸賽庚啶的免疫膠體金檢測卡及其制備方法。

背景技術

鹽酸賽庚啶（Cyproheptadinehydrochloride，分子式：C₂₁H₂₁N·HCl)是一種抗組胺藥，具有抗5-HT、阻斷H1受體及抗膽堿作用，主要用于治療蕁麻疹、濕疹、接觸性皮炎、皮膚瘙癢、過敏性鼻炎等，其常見的副作用為輕、中度的嗜睡、頭昏、乏力、口干等。食用含有鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶殘留的動物源性產品，對人體健康具有一定的危害性。農業部于2010年12月27日發布1519號公告，禁止在飼料和動物飲水中使用鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶。但在飼料安全預警預測監測工作中，發現國內某些飼料產品添加鹽酸賽庚啶。因此，加強對鹽酸賽庚啶殘留的檢測迫在眉睫。目前對它們的研究主要在醫藥領域，僅有飼料中鹽酸賽庚啶的檢測標準方法，而動物尿液和動物組織中殘留的相應檢測方法和限制標準未見研究報道，由此造成了食品安全監測的盲區。檢測動物尿液中鹽酸賽庚啶的含量顯得更直接、方便，且可實現宰前檢測，為及時排除食品安全隱患，保障食品的質量安全，特開展本試驗方法研究。

現有技術對于鹽酸賽庚啶的檢測主要是高效液相色譜-串聯質譜法、高效液相色譜法等檢測方法，但這些技術的缺陷明顯：設備昂貴、操作復雜、難以推廣。所以，建立一種簡單、有效、適合基層使用的測定方法是極其必要的。本發明的目的是研制一種更適合企業進行現場檢測且快捷簡便、成本低廉的定性檢測方法。

發明內容

針對以上情況，本發明的目的就是為了克服現有技術存在的缺陷而提供一種鹽酸賽庚啶的免疫膠體金檢測卡及其制備方法，可有效解決能快速、簡便地檢測出β-腎上腺素受體激動劑鹽酸賽庚啶的問題。

本發明的鹽酸賽庚啶膠體金檢測卡，包括包被了單克隆抗體膠體金標記物的膠體金結合墊、包被了鹽酸賽庚啶-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水墊、PVC膠板和塑料模具組成，在PVC膠板的一端依次粘附樣品墊、結合墊，中間黏貼硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。

本發明的鹽酸賽庚啶膠體金檢測卡的制備方法，是由以下步驟實現：

(1)膠體金溶液制備：取1L三角燒瓶1個，加入超純水495mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl₄·3H₂O)5mL，配制成500mL0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)溶液5-7mL，繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8℃保存備用；

(2)抗體的預處理：將要標記的鹽酸賽庚啶抗體在1000r/min,4℃條件下，離心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀釋成1mg/mL；或者用0.01mol/LPBS稀釋成1mg/ml，過0.22μm濾膜；

(3)膠體金標記物的制備：取步驟(1)中的膠體金溶液40mL，用0.25mol/LK2CO3調節膠體金溶液pH至8.5，電磁攪拌器250r/min攪拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應10min；逐滴加入4mL10%BSA，繼續攪拌反應10min；金標抗體溶液常溫低速（1500r/min）離心10min，棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4℃，12000r/min離心20min，棄上清，收集沉淀，將沉淀用金標抗體稀釋液定容至1mL，制備成鹽酸賽庚啶單克隆抗體膠體金標記物；

(4)膠體金膜的制備：將步驟(3)鹽酸賽庚啶蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物用劃膜儀以5μL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37℃烘干3h，制成含鹽酸賽庚啶蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物的膠體金膜；

(5)包被膜制備：將羊抗鼠IgG抗體、鹽酸賽庚啶蛋白質偶聯物稀釋成1mg/mL，用劃膜儀依次以1μL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37℃包被2h后，室溫自然晾干或者37℃烘干；

(6)樣品墊前處理：將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；

(7)檢測卡的組裝：PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。