[發明專利]用于刀鱭不同生態型種群識別的分子標記

有效

• 申請號: 201410355166.5
• 申請日: 2014-07-24
• 公開（公告）號: CN104099423A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發明（設計）人: 劉東;朱國利;唐文喬
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海卓陽知識產權代理事務所(普通合伙) 31262
• 代理人: 金重慶

技術領域

本發明涉及魚類的分子生物學技術領域，具體地說，是一種用于刀鱭不同生態型種群識別的分子標記。

背景技術

魚類物種的界定涉及兩個層次，一是物種水平，二是種群水平。物種識別方法有外部形態判斷法、生化法，以及最近十幾年發展的一種分子標記的方法。形態判斷法常用于物種水平的鑒別；種群水平的識別，曾使用生化方法，但該方法較為繁鎖，且誤判率也較高，現基本上不再采用，取而代之的是一種分子標記的方法。因為分子標記的穩定性好，現被廣泛地應用于魚類種群識別、種群遺傳結構、遺傳作圖等理論研究，以及魚類保護生物學和魚類遺傳育種等實踐領域。

目前，基于DNA片段差異作為分子標記的主要有3種:?(1)?基于PCR的分子標記技術，如限制性片段長度多態性，隨機擴增多態性DNA，基因特異擴增片段長度多態性等；(2)基于重復序列的分子標記，如微衛星DNA和小衛星DNA；(3)基于轉座子的插入和缺失的分子標記，如Tc1和SINE。

SINE?(?short?interspersed?element?，?SINE?)稱短散在重復序列，序列長度一般僅為?100~?500?bp，?在真核生物基因組中的拷貝數為10³~10⁵，散布于生物基因組內。SINE具有3個結構域：5’端tRNA相關區、tRNA非相關區、3’端尾區。SINE在相關的逆轉座酶的介導下，通過“復制－插入”的機制，其復制子整合到宿主的基因組內。SINE插入到基因組內后，將會產生穩定的遺傳；而且宿主對SINE的插入缺乏刪除機制，使得不同種系基因組的等位點產生SINE的插入或缺失，通過“插入或缺失”性狀，可識別不同的種系或種群。

中國專利文獻CN103820467A公開了一種牡丹SINE類反轉錄轉座子序列的分離方法，先分離出牡丹SINE類反轉錄轉座子的部分序列，根據其序列設計引物；以所設計引物進行PCR反應，得到生物素標記的探針；提取牡丹基因組后進行酶切，得到基因組酶切片段；同時將兩條寡聚核苷酸鏈退火，形成雙鏈的寡聚核苷酸接頭，之后將酶切后的基因組片段與接頭連接，并以單引物的PCR擴增，進行基因組片段庫的富集；將生物素標記的探針與所得基因組片段雜交，篩選出目的片段；所得目的片段進行接頭PCR，將反應產物進行克隆及陽性菌篩選以后，測序，進行序列分析，得到牡丹SINE類反轉錄轉座子序列。目前，針對魚類開發的SINE分子標記非常稀少，本發明提供的對于名貴的刀鱭(Coilia?nasus)的不同生態型種群的SINE標記還未見研究報道。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種用于刀鱭不同生態型種群識別的分子標記。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：一種用于刀鱭不同生態型種群識別的分子標記，所述的分子標記為SINE插入位點的特異引物，所述的特異引物為Locus?18位點、Locus?40位點或Locus?58位點的引物的一種或者其組合，所述的引物序列分別為：

Locus?18位點的上游引物如SEQ?ID?NO.1所示，

Locus?18位點的下游引物如SEQ?ID?NO.2所示，

Locus?40位點的上游引物如SEQ?ID?NO.3所示，

Locus?40位點的下游引物如SEQ?ID?NO.4所示，

Locus?58位點的上游引物如SEQ?ID?NO.5所示，

Locus?58位點的下游引物如SEQ?ID?NO.6所示。

所述的分子標記用于識別刀鱭的不同種群。

所述的分子標記進行種群識別的方法，包括以下步驟：運用所述的分子標記通過PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳、克隆、測序獲得SINE位點的種群特異性的DNA片段，根據擴增片段數目、大小的差異性，識別出刀鱭的不同種群。

本發明優點在于：

基于SINE位點擴增片段的數目和大小的分子標記技術，可以快速、準確地確定刀鱭種群。

附圖說明

附圖1是刀鱭的6個不同種群：浙江象山港(XS)，上海崇明(CM)，江蘇靖江(JJ)，太湖(TH)，江西鄱陽湖(PY)，湖南洞庭湖(DT)種群，每個種群樣本數10尾（1－10），?Locus?18?DNA片段的擴增結果。

附圖2是刀鱭的6個不同種群：浙江象山港(XS)，上海崇明(CM)，江蘇靖江(JJ)，太湖(TH)，江西鄱陽湖(PY)，湖南洞庭湖(DT)種群，每個種群樣本數10尾（1－10），?Locus?40?DNA片段的擴增結果。