[發明專利]一種利用玉米黑粉菌熱擊蛋白啟動子進行球孢白僵菌遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 201410353304.6
• 申請日: 2014-07-23
• 公開（公告）號: CN104131029A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 張正坤;李啟云;張佳詩;路楊;徐文靜;鄭巖;杜茜;隋麗;任金平;田志來
• 申請（專利權）人: 吉林省農業科學院
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/66
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種利用玉米黑粉菌熱擊蛋白啟動子進行球孢白僵菌遺傳轉化方法。

背景技術

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是一種致病性與適應性很強，且寄主范圍廣的昆蟲病原真菌，已被作為昆蟲真菌制劑廣泛用于玉米螟(Ostrinia?furnacalis)的生物防治。在球孢白僵菌功能基因研究及基因工程育種過程中，啟動子是外源或內源基因導入效率的重要因素之一。

目前，球孢白僵菌的遺傳轉化啟動子主要采用來源于構巢曲霉的PgpdA啟動子，長度為2000余bp，雖然具有良好的轉化效率，但單一的啟動子對不同類型基因進行轉化時，會受到酶切位點而影響遺傳轉化載體的構建，其大小也會影響遺傳轉化載體的構建，并且影響轉化效率。因此，開發一種新的高效啟動子能夠為球孢白僵菌遺傳轉化載體的構建提供更多的選擇，為球孢白僵菌的功能性基因研究及基因工程育種奠定基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用玉米黑粉菌熱擊蛋白啟動子進行球孢白僵菌遺傳轉化方法，旨在解決上述背景技術中的不足。

本發明是這樣實現的，

一種利用玉米黑粉菌熱擊蛋白啟動子進行球孢白僵菌遺傳轉化方法，包括以下步驟：

(1)將來源于玉米黑粉菌熱擊蛋白啟動子hsp70構建到以抗草胺磷基因bar為篩選標記、綠色熒光蛋白GFP為標記基因、TtrpC為終止子的遺傳轉化載體上，得到hsp70-F質粒；

(2)利用PEG法將步驟(1)中構建的hsp70-F質粒轉入球孢白僵菌原生質體后均勻涂在帶有PPT抗性的查氏培養基上，恒溫培養。

優選地，在步驟(1)中，所述hsp70質粒的構建包括以下步驟：利用特異引物以質粒PF為模板擴增得PgpdA的全序列，克隆到pUCm-T載體上，形成pUC-PgpdA；然后用Xba?I和NcoI雙酶切pUC-PgpdA質粒，回收PgpdA片段，克隆到用相同酶切的PHD3-hsp70載體上，形成hsp70質粒；其中，所述特異引物序列為：

gpdAFPXba?I：5'-GCTCTAGACAATTCCCTTGTATCTCTACACACA-3'，

gpdARPNcoI：5'-CATGCCATGGAGTACTTAGGGGAAATAAAGGTTCT-3'。

相比于現有技術的缺點和不足，本發明具有以下有益效果：本發明應用來源于玉米黑粉菌熱激蛋白啟動子hsp70介導球孢白僵菌遺傳轉化，其轉化效率較常用的PgpdA啟動子高出近60％，該轉化過程并沒有影響轉化子的生物學特性及殺蟲毒力。

附圖說明

圖1是本發明hsp70-F質粒的構建流程示意圖；

圖2是本發明實施例中球孢白僵菌原生質體的鏡檢觀察圖；

圖3是本發明實施例中球孢白僵菌轉化后在平板培養基上生長狀況比較圖；其中，圖3a為轉入hsp70-F質粒的球孢白僵菌培養基，圖3b為對照組；

圖4是本發明實施例中用hsp70特異性引物對孢白僵菌轉化子基因組DNA進行PCR檢測后的電泳結果圖；

圖5是本發明實施例中hsp70-F質粒轉化子熒光顯微檢測結果圖。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

實施例1遺傳轉化載體的構建

如圖1所示，將來源于玉米黑粉菌熱擊蛋白啟動子hsp70構建到以抗草胺磷基因bar為篩選標記、綠色熒光蛋白GFP為標記基因、TtrpC為終止子的遺傳轉化載體上。具體過程如下：

利用特異引物以質粒PF為模板擴增得PgpdA的全序列，克隆到pUCm-T載體上，形成pUC-PgpdA，并測序驗證。然后用Xba?I和NcoI雙酶切pUC-PgpdA質粒，回收PgpdA片段(約2200bp)，克隆到用相同酶切的PHD3-hsp70載體上，形成hsp70-F載體。

其中，特異引物序列為：

gpdAFPXba?I：5'-GCTCTAGACAATTCCCTTGTATCTCTACACACA-3'，

gpdARPNcoI：5'-CATGCCATGGAGTACTTAGGGGAAATAAAGGTTCT-3'。