[發明專利]利用抗萎銹靈基因carboxin為篩選標記的球孢白僵菌遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 201410353284.2
• 申請日: 2014-07-23
• 公開（公告）號: CN104131026A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 張正坤;李啟云;張佳詩;路楊;徐文靜;鄭巖;隋麗;杜茜;任金平;田志來
• 申請（專利權）人: 吉林省農業科學院
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/65;C12Q1/68
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種利用抗萎銹靈基因carboxin為篩選標記的球孢白僵菌遺傳轉化方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)遺傳轉化載體的構建：利用NotI和NodI限制性內切酶對otef:CAR載體和PF載體同時進行雙酶切并連接，將抗萎銹靈基因carboxin構建到pgpdA為啟動子，含有綠色熒光蛋白GFP標記基因，TtrpC為終止子的遺傳轉化載體上，構建PgpdA：car:GFP轉化載體；

2)球孢白僵菌原生質體的制備及轉化

原生質體的獲得

(1)將培養好的白僵菌菌液用漏斗過濾到空瓶中，留下濾布中得到的菌絲體；

(2)滲透壓緩沖液洗滌2-3遍，并用小勺收集菌絲到6mL?EP管中；

(3)在EP管中加入4mL的LB液體培養基，8μL?β-巰基乙醇，搖菌絲，使菌絲充分混入緩沖液中；

(4)28℃下100r/min培養20-25min；

(5)將小管第二次過濾，收集菌絲體，并用滲透壓緩沖液洗滌兩次；

(6)用小勺刮下濾布上的菌絲到新的EP管，加入4mL滲透壓緩沖液，再加入0.1g的酶粉振蕩；

(7)28℃下100r/min培養1h，并鏡檢觀察，此時視野中應得到透明圓球狀的原生質體；

萎銹靈抗性濃度的篩選

將制備的原生質體分別涂布于含有不同濃度梯度萎銹靈的查氏培養基上，萎銹靈濃度分別為0.5、1、2、3、4mg/ml培養基，并設置不含萎銹靈的培養基為對照，26℃培養48h后，觀察菌落生長情況；

3)PEG介導的遺傳轉化體系建立

(1)將得到的原生質體懸液吸取400μL到三個新的EP管中，做好標記，分別為CK對照和PgpdA：car:GFP質粒；

(2)對應管中分別加入10μLPgpdA：car:GFP質粒，質粒濃度60.5ug/μL，冰浴20min；

(3)每個管中各加入100μL?PEG4000溶液，混勻，冰浴20min；

(4)各加入2mLPEG4000，混勻，常溫放置5min；

(5)加入4mL的0.7mol/L山梨醇溶液稀釋；

(6)吸200μL于軟瓊脂平板上，封口標記，于28℃恒溫箱培養24h；

(7)將1mL的滲透壓緩沖液打在軟瓊脂平板上，重復吸打；吸出100μL均勻涂在帶有萎銹靈抗性的查氏培養基上，于28℃恒溫箱培養并觀察；

4)平均轉化效率分析

(1)對PgpdA：car:GFP載體進行球孢白僵菌原生質體遺傳轉化，每個載體轉化5個平板；

(2)轉化后對每個轉化平板進行轉化子數量的統計，取平均值，進行統計分析；

轉化子的PCR檢測及熒光觀察

(1)利用滅菌環將查氏培養基上的轉化子小心挑出，在提前準備的PDA平板上畫多個“Z”字，分別標記為轉PgpdA：car:GFP和CK；

(2)將劃好的平板置于26℃恒溫培養箱恒溫培養3d；

(3)此時得到轉化子第一代，繼續挑出孢子劃線在新的PDA培養基上，培養3d得到第二代孢子；

(4)同上述過程，得到第三代轉化子孢子，在超凈工作臺中挑出，置于SDY培養基中搖2-3d；

5)PCR檢測：利用氯化芐法提取球孢白僵菌轉化子基因組DNA，然后利用基因組做模版，利用GFP基因特異性引物，進行PCR及電泳檢測；

6)熒光觀察：菌絲從PDA上刮下后置于SDAY培養基中搖三天，將實驗控制在相同的培養條件及時間，在培養第48h置于倒置熒光顯微鏡下觀察。