[發(fā)明專利]一種利用MFH融合蛋白制備GLP-1多肽或其類似物方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410353241.4
• 申請日: 2014-07-23
• 公開（公告）號: CN104098702A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蘇正定;吳剛;趙以軍;李祝
• 申請（專利權(quán)）人: 湖北工業(yè)大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;C07K1/30;C07K1/22;C07K1/20;C07K14/605;C12P21/06;A61K38/26;A61P3/10
• 代理公司: 武漢科皓知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 常海濤

1.一種GLP-1多肽或其類似物的MFH融合蛋白，其特征在于結(jié)構(gòu)式為：MFH-DP-H6-E7-PEP；其中，MFH為蛋白融合載體；DP為L-天冬氨酸-L-脯氨酸序列；H6為組氨酸標簽，序列為L-組氨酸1-L-組氨酸2-L-組氨酸3-組氨酸4-L-組氨酸5-L-組氨酸6；E7為專一性蛋白酶切位點，其序列為：L-谷氨酸1-L-天冬氨酸2-L-亮氨酸3-L-酪氨酸4-L-苯丙氨酸5-L-谷氨酰胺6-L-X，X為除脯氨酸以外的任意L-型氨基酸；PEP為GLP-1多肽或其類似物，GLP-1的類似物包括R34，GLP-1多肽和R34的氨基酸序列分別如SEQ?ID?NO.1和2所示。

2.權(quán)利要求1所述的GLP-1多肽或其類似物的MFH融合蛋白的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）將編碼DP-H6-E7-PEP的DNA序列連接到pMFH質(zhì)粒上構(gòu)建GLP-1多肽或其類似物的原核表達質(zhì)粒pMFH-PEP；

（2）將pMFH-PEP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中得到表達融合蛋白MFH-DP-H6-E7-PEP的工程菌；

（3）融合蛋白表達：將表達MFH-DP-H6-E7-PEP的工程菌培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀達到0.9～1.0時，添加誘導(dǎo)劑IPTG或乳糖繼續(xù)發(fā)酵6小時以上，融合蛋白表達在包涵體中。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的GLP-1多肽或其類似物的MFH融合蛋白的制備方法，其特征在于：

誘導(dǎo)劑為IPTG時，融合蛋白表達的方法為：將表達融合蛋白MFH-DP-H6-E7-PEP的工程菌接種于LB中，37℃培養(yǎng)到OD₆₀₀值達到0.9～1.0時，添加誘導(dǎo)劑IPTG，終濃度為0.6～3mM，繼續(xù)發(fā)酵10～12小時；?

誘導(dǎo)劑為乳糖時，融合蛋白表達的方法為：將表達融合蛋白MFH-DP-H6-E7-PEP的工程菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)到OD₆₀₀值達到0.9～1.0時，加入誘導(dǎo)前補液；1小時后，先后再加入乳糖誘導(dǎo)液、乳糖后補料液，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)8～16小時；發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖5g/L、酵母浸膏15g/L、酪蛋白水解物20g/L、氯化鈉5g/L、硫酸銨1g/L、磷酸氫二鉀5g/L、磷酸二氫鉀2g/L、檸檬酸1g/L、硫酸鎂0.5g/L，微量元素溶液1mL/L，用去離子水配制初始pH?6.5～8.0；微量元素溶液為：硫酸亞鐵3.2g/L、氯化亞錳1g/L、硝酸鈷1.5g/L、氯化鈣1g/L、氯化銅0.05～0.5g/L、硫酸鋅0.4g/L、硼酸0.3g/L和鉬酸鈉0.8～4.2g/L溶于1mol/L鹽酸中；誘導(dǎo)前補液為：葡萄糖300g/L、硫酸鎂12g/L、氯化銨45g/L，用去離子水配制；乳糖誘導(dǎo)液為：乳糖180g/L、酵母浸膏180g/L、硫酸鎂7g/L，用去離子水配制；誘導(dǎo)后補料液為：甘油300g/L、乳糖75g/L、硫酸鎂7g/L，用去離子水配制。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的GLP-1多肽或其類似物的MFH融合蛋白的制備方法，其特征在于還包括乙醇沉淀純化，乙醇沉淀純化包括如下步驟：

（1）離心收集上述誘導(dǎo)表達的菌體，再用含6M尿素的PBS緩沖液重懸菌體后進行破碎，離心收集總蛋白上清液；

（2）往總蛋白上清液中加入等體積乙醇沉淀2～8小時，離心棄沉淀獲取一次乙醇上清液；

（3）往一次乙醇上清液中加入等體積乙醇第二次沉淀8～12小時，離心棄上清液，沉淀為純化的GLP-1多肽或其類似物的MFH融合蛋白。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的GLP-1多肽或其類似物的MFH融合蛋白的制備方法，其特征在于：所述的乙醇沉淀純化包括如下步驟：

（1）5000～6000轉(zhuǎn)/分離心15～30min收集誘導(dǎo)表達的菌體，用含6M尿素的PBS緩沖液重懸菌體，攪拌30分鐘，重懸液經(jīng)超聲波短暫預(yù)處理1分鐘，再經(jīng)高壓均質(zhì)機處理破粹細胞，細胞破粹液經(jīng)12000轉(zhuǎn)/分離心20～30分鐘，獲取總蛋白上清液；

（2）往總蛋白上清液中加入等體積乙醇于-20℃沉淀2～8小時，12000轉(zhuǎn)/分離心20～30分鐘，棄沉淀獲取一次乙醇上清液；

（3）往一次乙醇上清液中加入等體積乙醇于-20℃第二次沉淀8～12小時，12000轉(zhuǎn)/分離心20～30分鐘，棄上清液，沉淀為純化的GLP-1多肽或其類似物的MFH融合蛋白。