[發(fā)明專利]具有提高的5’-黃苷一磷酸生產(chǎn)力的棒狀菌菌株和用其生產(chǎn)5’-黃苷一磷酸的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410352698.3
• 申請日: 2009-12-17
• 公開（公告）號: CN104130966A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發(fā)明（設計）人: 趙鎮(zhèn)滿;金蕙園;李珍南;李智惠;吳潤錫;樸長熙
• 申請（專利權）人: CJ第一制糖株式會社
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P19/32;C12R1/15
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權代理有限公司 11245
• 代理人: 趙蓉民;陸惠中

本申請是分案申請，原申請的申請日為2009年12月17日、申請?zhí)枮?00980154009.5(PCT/KR2009/007559)、發(fā)明名稱為“具有提高的5’-黃苷一磷酸生產(chǎn)力的棒狀菌菌株和用其生產(chǎn)5’-黃苷一磷酸的方法”。

【技術領域】

本發(fā)明涉及重組載體，其具有圖1的切割圖中顯示的結構，攜帶SEQ?ID?NO.7的基因；和用該重組載體轉化的棒狀菌(Corynebacteria)菌株，其具有較內源性蘋果酸脫氫酶更高的活性。本發(fā)明還與使用該棒狀菌菌株產(chǎn)生5’-黃苷一磷酸的方法有關。

【背景技術】

5’-鳥苷一磷酸(在下文中被稱作“GMP”)是廣泛使用的作為增味劑的食品添加劑，如同肌苷一磷酸(在下文中被稱作“IMP”)。GMP引出鮮味(umami?taste)，其用途取決于也正被使用的谷氨酸一鈉(MSG)。它通常與IMP協(xié)同使用以增加MSG鮮味的強度。

迄今已知的制備GMP的方法的實例包括(1)酵母RNA的酶促降解，(2)直接微生物發(fā)酵成GMP，(3)微生物發(fā)酵成鳥苷，然后化學磷酸化，(4)微生物發(fā)酵成鳥苷，然后酶促磷酸化，(5)微生物發(fā)酵成黃苷5’-一磷酸(在下文中被稱作“XMP”)，然后通過棒狀菌菌株轉化成GMP，和(6)微生物發(fā)酵成XMP，然后通過具有氨基酶活性的大腸桿菌(Escherichia?coli)將XMP轉化成GMP。其中，方法(1)具有材料供應的困難和在經(jīng)濟上不是有益的，方法(2)由于GMP的膜通透性而遭受低產(chǎn)率的缺點。因此，其它方法在工業(yè)應用中廣泛使用。

對于生產(chǎn)XMP并將其轉化成GMP的方法，關鍵是增加XMP生產(chǎn)力。例如，韓國專利申請?zhí)?0-1991-018016公開了能以高產(chǎn)率產(chǎn)生XMP的XMP氨基酶無活性的菌株，其是腺嘌呤和鳥嘌呤半營養(yǎng)缺陷型，耐受鳥苷類似物并對溶菌酶非常敏感，溶菌酶是破壞細胞壁的酶。韓國專利申請?zhí)?0-2001-000513公開了能在培養(yǎng)基中以高濃度直接積累XMP的產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium?ammoniagenes)菌株和使用該菌株產(chǎn)生XMP的方法。菌株通過用UV光照射母體微生物、用誘變劑N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(NTG)處理和選擇耐受正纈氨酸的突變體而制備，正纈氨酸是纈氨酸的類似物，影響XMP的生物合成。韓國專利申請?zhí)?0-2008-006537描述了增加XMP產(chǎn)率的方法，其中XMP的生物合成中涉及的基因purN和purH被修飾。

另一方面，ATP生產(chǎn)力導致XMP產(chǎn)生，因為XMP的生物合成中涉及ATP。同樣，蘋果酸脫氫酶的活性對ATP的產(chǎn)生具有很大影響。然而，前述文件中任何地方都沒有提及經(jīng)設計提高蘋果酸脫氫酶活性以增加XMP產(chǎn)率的微生物和方法。

考慮到增加產(chǎn)生XMP菌株的ATP生產(chǎn)力是重要的，本發(fā)明人進行了集中研究并發(fā)現(xiàn)了引起該增加的基因。并且發(fā)現(xiàn)用串聯(lián)攜帶該基因的兩個拷貝的重組載體轉化的棒狀菌菌株能以高產(chǎn)率產(chǎn)生XMP。

【發(fā)明內容】

【技術問題】

因此本發(fā)明的目的是提供具有較內源性蘋果酸脫氫酶更高活性的棒狀菌菌株。

本發(fā)明的另一個目的是提供具有如圖1的切割圖中顯示的結構的重組載體，其攜帶SEQ?ID?NO.7的基因。

本發(fā)明另外的目的是提供用重組載體轉化的棒狀菌菌株。

本發(fā)明還有另外的目的是提供通過培養(yǎng)轉化的微生物和從培養(yǎng)物獲得XMP而生產(chǎn)XMP的方法。

【技術方案】

根據(jù)其方面，本發(fā)明涉及比內源蘋果酸脫氫酶活性增強的棒狀菌菌株。優(yōu)選地，將本發(fā)明的棒狀菌菌株修飾以具有較內源活性更高的蘋果酸脫氫酶活性，導致XMP生產(chǎn)力的增加。

術語“蘋果酸脫氫酶”，如本文所用，指通過脫氫催化蘋果酸鹽轉化成草酰乙酸鹽的酶。該酶伴隨乳酸脫氫酶在非常廣譜的活體生物中被發(fā)現(xiàn)，并且需要DPN和NAD作為其活性的輔因子，這些輔因子通常伴隨乳酸脫氫酶。在根據(jù)本發(fā)明的棒狀菌菌株中，將蘋果酸脫氫酶活性增加，從而以較高產(chǎn)率產(chǎn)生XMP。

如本文所用，術語“內源的活性”意欲指野生型微生物中的目標酶活性。術語“高于內源的活性”指與內源品種的活性相比增加的酶活性，不論起因于由酶自身引起的活性增加還是內源基因或外源基因引起的活性增加。例如，酶活性增加可通過本領域公知的任何方法實現(xiàn)，包括但不限于，增加或減少基因拷貝數(shù)、替換、修飾或突變目標啟動子等。