[發明專利]羧酸酯酶、其編碼基因及其應用

在審

• 申請號: 201410352516.2
• 申請日: 2014-07-23
• 公開（公告）號: CN104109659A
• 公開（公告）日: 2014-10-22
• 發明（設計）人: 黃遵錫;丁俊美;王超凡;李俊俊;慕躍林;楊云娟
• 申請（專利權）人: 云南師范大學
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;A62D3/02;C12R1/07;A62D101/28
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，尤其涉及一種羧酸酯酶、其編碼基因及其應用。

背景技術

鄰苯二甲酸二異丁酯(diisobutyl?phthalate,DIBP)屬于酞酸酯類化合物，是塑料工業中廣泛應用的增塑劑和軟化劑，其作用是增加塑料的可塑性和韌性，提高塑料強度(趙振華，環境化學，1991，10(3)：64-68)。此外，DIBP在涂料、印染、化妝品和香料的生產過程中應用也較為廣泛。近年來研究表明，DIBP僅靠分子間作用與高分子塑料結合，隨著時間的推移該類物質可以通過食品包裝材料直接遷移到食品中，也可通過含有該物質的塑料制品遷移到環境中，從而對空氣、水、土壤和食品等造成污染，并可通過呼吸、飲食和皮膚進入人體內，對人體造成危害(Zhang?et?al.,Environ?Geochem?Health,2014,36:505-515)。因此，尋找合理、有效的降解DIBP的方法和途徑逐漸成為各國研究者所關注的問題。由于生物降解是處理環境中DIBP類污染物的主要途徑，因此篩選高效專性或兼性的DIBP類有機污染物降解菌或降解酶成為研究的熱點。

羧酸酯酶(Carboxylesterases,EC3.1.1.1)是一類能夠催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特異性酯酶，與脂肪酶同屬于α/β水解酶家族成員，其氨基酸序列含有Ser-Asp-His三聯體結構，Ser，Asp，His構成了羧酸酯酶的催化活性中心(Nardini?et?al.,Current?Opinion?in?Structural?Biology,1999,9:732-737)。羧酸酯酶廣泛分布于動物、植物和微生物中(Melloney?et?al.,Journal?of?Molecular?Catalysis?B:Enzymatic,2005,32:261-270)，在催化酯水解、酯合成和酯交換等過程中具有重要應用價值，具有良好的區域選擇性和立體選擇性(Ramos?et?al.,Agricultural?and?Biological?Chemistry,1987,51:1833-1838)。但迄今為止，關于羧酸酯酶對酞酸酯類化合物降解的研究甚少。

利用微生物降解酞酸酯類化合物大多數是依靠胞內酶解作用，但由于野生菌株產酶能力有限、發酵周期長、純化復雜、難以大量生產，生產成本高，限制了其推廣應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種羧酸酯酶。

本發明的再一目的是提供編碼上述羧酸酯酶的基因。

本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。

本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。

本發明的另一個目的是提供上述羧酸酯酶在鄰苯二甲酸二異丁酯降解中的應用。

本發明所述羧酸酯酶CarEW可得自芽孢桿菌(Bacillus?sp.)，如Bacillus?sp.ATCC31072，羧酸酯酶CarEW的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發明的羧酸酯酶CarEW總共含有488個氨基酸，理論分子量為53.76kDa。該酶以4-硝基苯丁酸酯(pNPC₄)為最適底物；最適溫度45℃；最適pH值7.5；終濃度1mM的金屬離子K⁺、Cu²⁺、Na⁺和Zn²⁺對羧酸酯酶CarEW有激活作用，Ag⁺、Hg²⁺等對羧酸酯酶CarEW有較強的抑制作用；在37℃和45℃下保溫60min，羧酸酯酶的酶活分別保持在54％和58％以上；在pH值5.0～10.0的緩沖液中處理60min，羧酸酯酶的酶活在pH值7.0～8.0之間比較穩定，保持80％以上的酶活力；在pH值7.5及45℃反應時，羧酸酯酶CarEW對0.6mmol/L的pNPC₄比活力為636U±0.01U/mg。此外，羧酸酯酶CarEW對α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、乙酸-4-硝基苯酯(pNPC₂)、己酸-4-硝基苯酯(pNPC₆)、4-硝基苯基辛酸酯(pNPC₈)、對硝基苯酚癸酸酯(pNPC₁₀)、月桂酸-4-硝基苯酯(pNPC₁₂)等底物也具有很好的降解作用。

本發明提供了編碼上述羧酸酯酶的基因CarEW，該基因序列如SEQ?ID?NO.2所示。