[發(fā)明專利]一種重組SLO蛋白及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410349271.8
• 申請日: 2014-07-22
• 公開（公告）號: CN104098659A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陽艷華;黃英星
• 申請（專利權(quán)）人: 桂林英美特生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C07K14/315
• 分類號: C07K14/315;C07K1/18;C12N15/31;C12N15/70
• 代理公司: 桂林市持衡專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 45107
• 代理人: 唐智芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種重組SLO蛋白及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

溶血鏈球菌溶血素O(streptolysin?O，SLO)是由絕大多數(shù)A群溶血鏈球菌菌株和許多C、G群溶血鏈球菌菌株分泌的一種蛋白質(zhì)。85～90％鏈球菌感染的患者，于感染后2～3周至病愈后數(shù)月到1年內(nèi)可檢出SLO抗體。風(fēng)濕熱病人血清中的SLO抗體顯著增高，活動(dòng)性病例升高更為顯著，一般其效價(jià)在1：400以上。因此，檢測SLO抗體含量對鏈球菌新近感染或風(fēng)濕熱的臨床診斷有很重要的意義。

從天然的溶血鏈球菌菌株中提取SLO存在如產(chǎn)量低、操作風(fēng)險(xiǎn)大、不易于工業(yè)化生產(chǎn)等不足。近年來，已有通過基因重組SLO的技術(shù)，如公開號為CN101302526A的發(fā)明專利，公開了一種可溶性溶血鏈球菌溶血素O基因、該基因表達(dá)的重組蛋白及其制備方法，該發(fā)明運(yùn)用基因工程技術(shù)從溶血鏈球菌基因組中克隆得到截短的SLO基因，連接到表達(dá)載體上再轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞表達(dá)純化大量穩(wěn)定的r－sSLO蛋白，克服了天然提取的各種缺點(diǎn)，有利于以該蛋白為原材料制備各種試劑的標(biāo)準(zhǔn)化。但該發(fā)明在重組蛋白純化時(shí)采用親和純化技術(shù)，生產(chǎn)成本較高，不易于產(chǎn)業(yè)化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種重組SLO蛋白及其制備方法。本發(fā)明所述方法采用pGEX-2T表達(dá)質(zhì)粒與SLO基因序列重組，結(jié)合DEAE-Sepharose陰離子交換柱純化技術(shù)，不僅產(chǎn)率高，而且所得重組SLO蛋白的純度大于90％。

本發(fā)明所述的重組SLO蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：4所示。

上述重組SLO蛋白的制備方法，包括以下步驟：

1)SLO基因的擴(kuò)增及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)SLO的基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增該基因并與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌DH5α，篩選陽性工程菌并提取質(zhì)粒做雙酶切及DNA測序驗(yàn)證，將正確的陽性質(zhì)粒雙酶切獲得擴(kuò)增的SLO核苷酸序列并與表達(dá)質(zhì)粒pGEX-2T連接，構(gòu)建SLO-pGEX-2T表達(dá)質(zhì)粒；

2)重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌及陽性工程菌的篩選

將構(gòu)建的SLO-pGEX-2T表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌BL21，篩選陽性工程菌進(jìn)行培養(yǎng)，從所得菌液中篩選出表達(dá)目的蛋白的陽性工程菌；

3)陽性工程菌的擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)

將所得的表達(dá)目的蛋白的陽性工程菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后再進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到表達(dá)菌液；

4)表達(dá)菌液的收集、裂解和目的重組蛋白的純化

將所得表達(dá)菌液離心，沉淀用bufferA溶解后再裂解，裂解后加入Lysis?buffer，靜置，離心，上清液透析后上DEAE-Sepharose陰離子交換柱，收集流出液，重復(fù)一次上柱操作，得到純度大于90％的重組SLO蛋白。

更為具體的制備方法包括以下步驟：

1)根據(jù)SLO的基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增該基因并與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂板后篩選陽性工程菌，并對其擴(kuò)大培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒做雙酶切及DNA測序驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的陽性質(zhì)粒雙酶切獲得擴(kuò)增的SLO核苷酸序列并與表達(dá)質(zhì)粒pGEX-2T連接，構(gòu)建SLO-pGEX-2T表達(dá)質(zhì)粒；

2)將構(gòu)建的SLO-pGEX-2T表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌BL21，涂板后篩選若干陽性工程菌，并將其分別接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，35～40℃條件下?lián)u床培養(yǎng)12～16h，之后每管加入IPTG誘導(dǎo)，控制IPTG的終濃度為0.1～2mmol/L，30～32℃條件下?lián)u床誘導(dǎo)5～8h，收集菌液，取樣做SDS-PAGE電泳檢測，篩選出表達(dá)目的蛋白的陽性工程菌；

3)將所得的表達(dá)目的蛋白的陽性工程菌接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，35～40℃條件下?lián)u床培養(yǎng)12～16h，所得菌液接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，35～40℃條件下?lián)u床進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，直至菌液在600nm處的吸光值介于0.7～1之間，之后將IPTG加入菌液中，使IPTG終濃度為0.1～2mmol/L，30～32℃條件下?lián)u床誘導(dǎo)5～8h，得到表達(dá)菌液；

4)所得表達(dá)菌液離心，沉淀用bufferA溶解，然后將菌液進(jìn)行超聲波裂解，在裂解后的菌液中加入等體積的Lysis?buffer，靜置，離心，上清液用Dialysis?buffer進(jìn)行透析，透析后的上清樣上DEAE-Sepharose陰離子交換柱，收集流出液，重復(fù)一次上柱操作，得到純度大于90％的重組SLO蛋白。