[發(fā)明專利]小RNA miR-20b在制備抗炎藥物中的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410349266.7
• 申請(qǐng)日: 2014-07-22
• 公開（公告）號(hào): CN104147615A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尹芝南;吳震州;趙立青;朱恩東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南開大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;A61P29/00;A61P37/02
• 代理公司: 天津佳盟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術(shù)領(lǐng)域

?本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及非編碼小RNA基因miR-20b在藥物上的應(yīng)用，特別涉及miR-20b在制備涉及自身免疫性疾病相關(guān)藥物和抗炎藥物的應(yīng)用。

背景技術(shù)

免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)是維持機(jī)體正常運(yùn)行的基礎(chǔ)，其通過產(chǎn)生各種免疫細(xì)胞及分泌各種細(xì)胞因子和抗體來抵御外來物侵?jǐn)_或調(diào)控相關(guān)免疫進(jìn)程，而免疫細(xì)胞的異常分化或細(xì)胞因子的表達(dá)異常則會(huì)導(dǎo)致各種炎癥的發(fā)生。

Th17細(xì)胞可以分泌細(xì)胞因子IL-17A和IL-17F，并表達(dá)亞系特異性轉(zhuǎn)錄因子RORC（小鼠中為RORγt）。在Th17細(xì)胞的產(chǎn)生過程中，轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）和炎癥細(xì)胞因子IL-6，IL-21，IL-1β和IL-23等發(fā)揮重要調(diào)控作用。Th17細(xì)胞對(duì)于胞外病原體的清除至關(guān)重要，其中包括念球菌屬和克雷伯氏菌屬等病原菌，但是，在特定條件下，Th17細(xì)胞及其效應(yīng)性細(xì)胞因子IL-17、IL-21、IL-22、GM-CSF和CCL20等也會(huì)引起一些自身免疫性和炎癥性疾病的發(fā)生，例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、銀屑病、腸炎、過敏和哮喘等。

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一個(gè)龐大的家族，大約為21nt（核苷酸）長(zhǎng)度的非編碼RNAs，通過轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)從而發(fā)揮其調(diào)控作用，廣泛存在于包括植物和動(dòng)物在內(nèi)的真核生物中。miRNAs可以影響生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞進(jìn)程（增殖、凋亡、粘附、遷移等）等，對(duì)人類癌癥發(fā)生及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)均發(fā)揮重要調(diào)控作用。

近年，miRNAs在免疫系統(tǒng)中的重要作用日益被揭示，已經(jīng)證實(shí)miRNAs廣泛參與了免疫系統(tǒng)的發(fā)育，以及各種淋巴細(xì)胞的分化和抗體產(chǎn)生。在一些炎癥性疾病中，諸如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡，miRNAs廣泛參與了疾病的起始和進(jìn)展。而通過干預(yù)相關(guān)miRNAs的異常表達(dá)可以有效緩解疾病的發(fā)生和發(fā)展。

我們認(rèn)為通過鑒定并研究miRNAs在某些炎癥中的表達(dá)及作用，可以發(fā)現(xiàn)一批關(guān)鍵的miRNAs從而可以有效提高這種炎癥的診斷及治療水平。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種小分子RNA基因miR-20b在制備抗炎藥物中的應(yīng)用，該miR-20b能夠有效抑制由Th17細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)。

本發(fā)明所述的miR-20b在Th17細(xì)胞中特異性低表達(dá)，且分別給na?ve?CD4⁺?T細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-20b模擬體或miR-20b陰性對(duì)照后，miR-20b模擬體能夠顯著減少細(xì)胞因子白介素17A基因水平以及蛋白水平表達(dá)，且miR-20b不改變Th17細(xì)胞增殖和凋亡的水平，表明miR-20b能夠有效抑制Th17細(xì)胞的分化且不依賴對(duì)細(xì)胞數(shù)量的調(diào)控。

本發(fā)明所述的應(yīng)用為小RNA?miR-20b在制備抗炎藥物中的應(yīng)用，該治療抗炎的藥物為治療由反應(yīng)性Th17細(xì)胞廣泛參與并發(fā)揮重要致病作用的炎癥反應(yīng)的藥物，如特別參與的涉及自身免疫性疾病及炎癥相關(guān)的藥物。

本發(fā)明提供的miR-20b由以下核苷酸組成：5’-CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG-3’。

本發(fā)明首先在體外分化由流式細(xì)胞儀分選的幼稚型（na?ve）CD4⁺?T細(xì)胞，從而得到體外分化的中性（neutral）、Th1、Th2、Th17、誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞，并利用實(shí)時(shí)定量PCR（real-time?PCR）技術(shù)分析miR-20b的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別與neutral分化細(xì)胞相比，miR-20b在Th17細(xì)胞中較之Th1、Th2和Treg細(xì)胞特異性低表達(dá)。

其次，本發(fā)明中流式分選na?ve?CD4⁺?T細(xì)胞，在Th17條件下分化培養(yǎng)，分別給細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-20b陰性對(duì)照（miR-20b?NC）及模擬體（miR-20b?mimics）后，miR-20b?mimics能夠顯著減少細(xì)胞因子白介素17A基因水平以及蛋白水平表達(dá)，表明miR-20b能夠有效抑制Th17細(xì)胞的分化。

同時(shí)，本發(fā)明中流式分選na?ve?CD4⁺?T細(xì)胞，在Th17條件下分化培養(yǎng)，分別給細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-20b陰性對(duì)照（miR-20b?NC）及模擬體（miR-20b?mimics）后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-20?mimics在體外對(duì)Th17細(xì)胞的增殖和凋亡是沒有影響的。說明miR-20b在本質(zhì)上對(duì)Th17細(xì)胞的分化產(chǎn)生了抑制，而不會(huì)改變細(xì)胞的數(shù)量。

因此，miR-20b在制備由Th17細(xì)胞特別參與的涉及自身免疫性疾病及炎癥相關(guān)的藥物方面有巨大潛力。