[發明專利]基于DNA條形碼的鑒別烏梢蛇的引物及PCR-RFLP方法和試劑盒

無效

• 申請號: 201410348910.9
• 申請日: 2014-07-21
• 公開（公告）號: CN104164494A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 晁志
• 申請（專利權）人: 晁志
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海麥其知識產權代理事務所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

1.用于鑒別烏梢蛇PCR-RFLP方法的PCR擴增引物，其特征在于，所述引物序列為：

DK1-CO1：5’-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’；

DK1-CO2：5’-CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。

2.一種烏梢蛇的PCR-RFLP鑒定方法，其特征在于，利用能夠識別烏梢蛇特征DNA堿基序列5’-ACTAGT-3’的限制性內切酶Spe?I，與不能識別烏梢蛇特征DNA堿基序列5’-GGAAACC-3’的限制性內切酶BstE?II，共同對純化后的PCR產物進行消化，產生瓊脂糖凝膠電泳的特征圖譜；所述鑒定方法包括以下步驟：

1)樣品DNA的提取；

2)擴增DNA片段：利用權利要求1所述的引物進行聚合酶鏈反應，得到聚合酶鏈反應擴增產物，所述PCR反應參數包括：93℃預變性5min，55℃2min；93℃變性30s，55℃復性45s，70℃延伸45s，35個循環；70℃延伸5min；

3)瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化PCR產物；

4)在所述PCR純化產物中加入限制性內切酶Spe?I和BstE?II進行雙酶切，所述限制性內切酶Spe?I的酶切位點為A^CTAGT；所述限制性內切酶BstE?II的酶切位點為G^GTNACC；

5)瓊脂糖凝膠電泳分析；

6)鑒定結果的判斷：若在所述電泳產物中檢測到分子量為121bp和537bp的兩條片段，則待測樣品為烏梢蛇；若不出現上述兩條片段或多于兩條片段，則供試品不為烏梢蛇。

3.一種用于烏梢蛇PCR-RFLP鑒定方法的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：10μM引物DK1-CO1；10μM引物DK1-CO2；2×Taq?DNA聚合酶混合緩沖液，其包括：0.1U/μL?Taq?DNA聚合酶，dATP、dTTP、dCTP及dGTP各500μM，20μMTris-HCl、pH8.3，100μM?KCl，3μM?MgCl₂；10U/μL?Spe?I酶；10U/μL?BstE?II酶；酶切緩沖液；終止緩沖液；滅菌雙蒸水。