[發(fā)明專利]蘋果潛隱病毒和類病毒的多重RT-PCR檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410347974.7
• 申請日: 2014-07-21
• 公開（公告）號: CN104164517A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周濤;郝璐;陳善義;范在豐;國立耘;葉婷
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.蘋果潛隱病毒和類病毒的多重RT-PCR檢測引物組合，其特征在于，所述引物組合包括：

用于特異性RT-PCR檢測蘋果褪綠葉斑病毒(Apple?chlorotic?leaf?spot?virus)的引物對I：

ACLSV-F?5′-GAGANTTTCAGTTTGCTMGA-3′

ACLSV-R?5′-AGTCTACAGGCTATTTATTATAAGT-3′

其中，N為A或G，M為A或C；

用于特異性RT-PCR檢測蘋果莖溝病毒(Apple?stem?grooving?vir?us)的引物對II：

ASGV-F?5′-TGGAAACCGAGGATGGACAG-3′

ASGV-R?5′-CTGGTACCCAAACCCAAGCCTTAG-3′；

用于特異性RT-PCR檢測蘋果莖痘病毒(Apple?stem?pitting?virus)的引物對III：

ASPV-F?5′-GAAGTAATCGCATCATTCAC-3′

ASPV-R?5′-GATATGTACCTATTGATGGTTTC-3′；以及

用于特異性RT-PCR檢測蘋果銹果類病毒屬(Apscarviroid)3種類病毒：蘋果銹果類病毒(Apple?scar?skin?viroid)、蘋果凹果類病毒(A?pple?dimple?fruit?viroid)和蘋果皺果類病毒(AFCVd)的通用引物對IV：

apscarviroids-F?5′-AGACCCTTCGTCGACGACGA-3′

apscarviroids-R?5′-TGTCCCGCTAGTCGAGCGGA-3′。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組合，其特征在于，所述引物組合中還包括用于特異性RT-PCR檢測內(nèi)參基因ER-1α的引物對V：

ER-1α-F?5′-TCATCATGAACCACCCCG-3′

ER-1α-R?5′-CCTGTCCAGAACCCAATTC-3′。

3.含有權(quán)利要求1或2所述引物組合的用于多重RT-PCR檢測蘋果潛隱病毒和類病毒的試劑盒。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、DNaseⅠ、DEPC水、dNTPs、Taq?DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應(yīng)緩沖液中的至少一種。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。

6.權(quán)利要求3-5任一項所述試劑盒在多重RT-PCR檢測蘋果潛隱病毒和類病毒中的應(yīng)用。

7.蘋果潛隱病毒和類病毒的多重RT-PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)提取待測蘋果樣品中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得第一條cDNA鏈；

2)以步驟1)中獲得的cDNA為模板，利用權(quán)利要求2所述引物組合進行特異性PCR擴增反應(yīng)；

3)分析PCR產(chǎn)物。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟1)具體為：提取待測蘋果樣品中的總RNA，向反應(yīng)管中加入蘋果樣品RNA3.5μL、10μM隨機引物0.5μL、10μM?Oligo?dT0.5μL、5×M-MLV酶緩沖液4.0μL、10mM?dNTPs1.0μL、RNA酶抑制劑0.5μL、200U/μL?M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL，加DEPC?ddH₂O至總體積20μL，于42℃反應(yīng)1h，即得第一條cDNA鏈。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟2)中進行PCR擴增使用的PCR反應(yīng)體系以25μl計為：

PCR反應(yīng)條件為：94℃3分鐘；94℃30秒，53℃45秒，68℃2分鐘，共35個循環(huán)；72℃10分鐘。

10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項所述的方法，其特征在于，待測蘋果樣品來自于蘋果的葉片、枝條、花或果實。