[發明專利]一種基于實時熒光定量PCR平臺的基因突變分析判定方法

有效

• 申請號: 201410345144.0
• 申請日: 2014-07-18
• 公開（公告）號: CN104099421B
• 公開（公告）日: 2017-01-04
• 發明（設計）人: 王弢;李宗飛;張利清;張麗;樂飚;徐維琛
• 申請（專利權）人: 普世華康江蘇醫療技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 蘇州華博知識產權代理有限公司32232
• 代理人: 何蔚

技術領域

本發明涉及基因突變分析領域，特別是涉及基于實時熒光定量PCR平臺的基因突變分析判定方法。

背景技術

目前現有判定基因突變的方法主要包含以下幾種：

(1)高分辨率溶解曲線(high?resolution?melting，HRM)。高分辨率溶解曲線是基于核酸的物理性質，通過飽和染料結合于PCR擴增產物，監控產物熔解曲線的變化分析基因突變。檢測敏感性在5％左右，對于陽性結果并不能確定其具體位置，最終還需要通過測序加以確認。

(2)探針擴增阻滯突變法(amplification?refractory?mutation?system，ARMS)。利用PCR引物的3’端末位堿基必須與其模板DNA互補才能有效擴增的原理，設計針對突變位點的特異性PCR擴增引物，在嚴格的條件下，只有在引物3’堿基與模板配對時PCR擴增反應才能正常進行，從而檢測出突變。通過設計兩個5’端引物，一個與正常DNA互補，一個與突變DNA互補，對于純和性突變，分別加入兩種引物及3’端引物進行兩個平行的PCR，結合有與突變DNA完全互補的引物才可以延伸并得到PCR擴增產物，該檢測方法的靈敏度在1％左右。

(3)等位基因特異的Taqman聚合酶鏈式反應(competitive?allele-specific?TaqMan?polymerase?chain?reaction，CAST-PCR)。CAST-PCR法采用優化TaqMan探針，通過一段特異設計的MGB探針來阻止引物與野生型DNA結合，選擇性的優先擴增突變型DNA，該檢測方法的靈敏度在1-0.1％左右。

以上這些方法檢測的靈敏度較低、主觀性強，容易造成誤判。

發明內容

本發明提供了一種基于實時熒光定量PCR平臺的基因突變分析判定方法，該分析判定方法對于PCR結果判讀明確客觀，誤判率低，大大提高對于基因突變檢測分析的準確性和靈敏度。

為實現上述技術目的，本發明的技術方案是：一種基于實時熒光定量PCR平臺的基因突變分析判定方法，利用目的基因的熒光定量PCR擴增結果進行分析判別，所述分析判定方法的步驟如下：

第一步、在PCR實驗結束以后，將實驗結果運行CT值的計算，判斷CT值，以確定是否繼續分析實驗情況；

第二步、運行內控，根據內控結果判定DNA樣品是否合格；

第三步、運行陽性質控品，根據陽性質控品的CT值判定實驗體系是否合格；

第四步、如果CT值經上述步驟檢驗分析合格，則運行Tm?calling程序，通過熔解曲線分析和CT值分析，判讀樣本是否存在突變。

其中，所述第一步判斷CT值，是指當CT值≥cut-off值時，表明無模板對照應無特異擴增，或僅引物二聚體導致的熒光信號增強，對試驗的影響極微，可以繼續分析。

其中，cut-off值是設定的臨界值，可以是40.0或45.0或50.0。

其中，所述無模板對照無特異擴增或僅引物二聚體導致的熒光信號增強，是指運行Tm?calling程序時，溶解曲線最高峰的Tm值不在相應突變的范圍內。

其中，所述第二步根據內控結果判定，是指當CT值＜cut-off值，可以繼續分析，如果CT值≥cut-off值，則說明樣品DNA降解嚴重，不適合試驗需要。

其中，所述第三步根據陽性質控品的CT值判定，是指當CT值＜cut-off值，溶解曲線最高峰的Tm值在相應突變的范圍內，說明試驗體系正常，可以繼續分析試驗結果。

其中，所述第四步具體為：運行Tm?calling程序，若樣本溶解曲線最高峰的Tm值在相應突變的范圍內，并且CT值＜cut-off值，表明擴增區段發生突變；

若樣本存在以下三種情況之一，則判斷為陰性：

a，無擴增；

b，有擴增，CT值≥cut-off值；