[發明專利]一種檢測肺癌熱點突變基因的組合物及其使用方法

有效

• 申請號: 201410344467.8
• 申請日: 2014-07-18
• 公開（公告）號: CN104152551A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 王弢;李宗飛;張利清;張麗;樂飚;徐維琛
• 申請（專利權）人: 普世華康江蘇醫療技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 蘇州華博知識產權代理有限公司 32232
• 代理人: 何蔚

技術領域

本發明涉及基因檢測領域，特別是涉及檢測肺癌驅動基因熱點突變的組合物。?

背景技術

肺癌是一類高發病率、高死亡率的惡性腫瘤。近10年來，我國肺癌的發病率與死亡率快速增長。肺癌的發病部位有所不同，根據各型肺癌的分化程度和形態特征，目前將肺癌分為兩大類，即小細胞肺癌和非小細胞肺癌，后者包括鱗癌、腺癌和大細胞癌。?

研究發現，肺癌的發生與EGFR、KRAS、PIK3CA熱點基因的突變有很大的關系。?

EGFR基因表達于正常上皮細胞表面，而在一些腫瘤細胞中常過表達，EGFR的過表達和腫瘤細胞的轉移、侵潤、預后差有關。EGFR下游的信號轉導通路主要有兩條：一條是Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK通路，而另一條是PI3K/Akt/mTOR通路。當信號傳導至細胞核后，引起核內基因轉錄水平的增加，使細胞增殖、轉化。EGFR信號傳導的異常是導致多種腫瘤發生的原因。?

K-ras基因位于12號染色體短臂上，35kb，屬于Ras基因家族的一員。在Ras基因中，K-Ras對人類癌癥影響最大，它好像分子開關：當正常時能控制調控細胞生長的路徑；發生異常時，則導致細胞持續生長，并阻止細胞自我毀滅。它參與細胞內的信號傳遞，當K-ras基因突變時，該基因永久活化，不能產生正常的ras蛋白，使細胞內信?號傳導紊亂，細胞增殖失控而癌變。?

PIK3CA基因編碼Ⅰ類磷脂酰肌醇-3-激酶的p110催化亞單位，正常情況下在肺、乳腺、胃腸和卵巢等器官中均有表達，具有調控體細胞增殖、分化、存活等許多重要功能。研究發現PIK3CA基因產生突變與肺癌等多種癌癥發病存在相關性，4％的肺癌患者體內基因PIK3CA存在突變。?

目前檢測基因突變的方法主要有以下幾種：?

(1)直接測序法。直接測序法是運用探針進行PCR擴增并對擴增產物進行測序和TA克隆并再次測序以最終確定突變的堿基位置。該方法比較繁瑣、耗時長，而且由于自身的限制導致其靈敏度不高，只能對含量大于20％的基因突變進行檢測。因此，此法不適合在臨床中的應用與大量的臨床樣本分析。?

(2)變性高效液相色譜法(DHPLC)。該方法的原理是基于發生錯配的雜合雙鏈DNA與完全匹配的純合雙鏈DNA解鏈特征的差異將他們分離開。通過洗脫峰的不同判斷有無突變存在。DHPLC可檢測出含有單個檢測的突變、插入或者缺失的異源雙鏈片段。該法對已知和未知的突變位點均可以檢測，敏感性在5％左右，但檢測過程中需要打開反應管，容易造成污染，而且陽性結果不能確認其具體未知，最終還需測序確認。?

(3)高分辨率熔解曲線(HRM)。高分辨率熔解曲線是基于核酸的物理性質，通過飽和染料結合于PCR擴增產物，監控產物熔解曲線的變化分析基因突變。檢測敏感性在5％左右，對于陽性結果并不能確定其具體位置，最終還需要通過測序加以確認。?

(4)探針擴增阻滯突變法(ARMS)。利用PCR引物的3’端?末位堿基必須與其模板DNA互補才能有效擴增的原理，設計針對突變位點的特異性PCR擴增引物，在嚴格的條件下，只有在引物3’堿基與模板配對時PCR擴增反應才能正常進行，從而檢測出突變。通過設計兩個5’端引物，一個與正常DNA互補，一個與突變DNA互補，對于純和性突變，分別加入兩種引物及3’端引物進行兩個平行的PCR，結合有與突變DNA完全互補的引物才可以延伸并得到PCR擴增產物,該檢測方法的靈敏度在1％左右。?

(5)等位基因特異的Taqman聚合酶鏈式反應(CAST-PCR)。CAST-PCR法采用優化TaqMan探針，通過一段特異設計的MGB探針來阻止引物與野生型DNA結合，選擇性的優先擴增突變型DNA，該檢測方法的靈敏度在1～0.1％左右。?

但這些技術的靈敏度都不高，檢測的特異性差，誤診率高，不能滿足對肺癌檢測的需求。?

發明內容

本發明的目的是提供一種肺癌熱點基因無創檢測的組合物，該組合物及其使用方法特異性強且靈敏度高。?