[發(fā)明專利]一種抗菌肽及其在制備抗感染藥物、抗腫瘤藥物、免疫促進(jìn)劑和飼料添加劑中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410344397.6
• 申請(qǐng)日: 2014-07-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104098666B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-03-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 石應(yīng)輝;徐冬玲;桂向東;李曉祥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽新星生物工程有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/435
• 分類號(hào): C07K14/435;C12N15/12;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/19;A61K38/17;A61P31/04;A61P35/00;A61P37/04;A23K20/195;A23K50/30
• 代理公司: 杭州天勤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司33224
• 代理人: 胡紅娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗菌肽及其在制備抗感染藥物、抗腫瘤藥物、免疫促進(jìn)劑和飼料添加劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

抗菌肽(antibacterial?peptide)是一類在一定誘導(dǎo)條件下，由宿主細(xì)胞特定編碼基因產(chǎn)生的、對(duì)抗外源性病原體致病作用的防御性多肽類的總稱，具有廣譜的抗菌、抗病毒作用，是天然免疫系統(tǒng)的組成部分。

抗菌肽具有分子量小、穩(wěn)定性高、無(wú)免疫原性等特點(diǎn)。部分抗菌肽具在l00℃下加熱10～15min仍能保持其活性；同時(shí)，抗菌肽對(duì)較大的離子強(qiáng)度和較高或較低的pH值均具有較強(qiáng)的抗性，部分抗菌肽尚具備抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力。

1975年瑞典科學(xué)家G.Boman等人(Steinerhd?et?al.Nature,1981,292:246-248.)從惜古比天蠶(Hyatophoracecropia)的蛹中誘導(dǎo)分離得到一種殺菌肽，并將其命名為cecropin。此后許多抗菌肽相繼被分離、純化。一些抗菌肽的氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)和基因序列得到確定。其后的抗菌肽研究，早期主要集中在大型的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)來(lái)源的抗菌肽、其后又?jǐn)U展到來(lái)源于一些小型昆蟲(chóng)、無(wú)脊椎動(dòng)物及脊椎動(dòng)物(特別是兩棲動(dòng)物)乃至哺乳動(dòng)物的抗菌肽；另外，細(xì)菌和植物來(lái)源的抗菌肽也一直是研究的熱點(diǎn)。

已報(bào)道的抗菌肽除了具有廣譜的抗菌、抗病毒作用外，還對(duì)部分原蟲(chóng)具備殺滅作用；更為令人感興趣的是，一些抗菌肽對(duì)癌細(xì)胞具有強(qiáng)有力的殺傷作用，有些抗菌肽還具有免疫刺激功能。廣袤自然界中還有更多具備強(qiáng)大功能的抗菌肽有待挖掘。

抗菌肽中最大的一類陽(yáng)離子抗菌肽，其作用機(jī)理是破壞細(xì)胞膜，破壞其完整性并產(chǎn)生穿孔現(xiàn)象，造成細(xì)胞內(nèi)容物溢出胞外而死亡，而不是作用于某個(gè)靶點(diǎn)酶或者受體。所以在應(yīng)用上，抗菌肽還具有傳統(tǒng)抗生素?zé)o法比擬的優(yōu)越性，即不會(huì)誘導(dǎo)抗藥菌株的產(chǎn)生。

鑒于抗菌肽的這些特點(diǎn)和功能，長(zhǎng)期以來(lái)，許多科學(xué)家和技術(shù)人員致力于抗菌肽應(yīng)用于抗菌藥物、抗腫瘤藥物、動(dòng)物保健品和飼料添加劑等方面的研究和開(kāi)發(fā)。

但是，抗菌肽的天然產(chǎn)量低，天然提取步驟復(fù)雜、產(chǎn)率低；而化學(xué)合成則價(jià)格相當(dāng)昂貴；所以利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗菌肽，是抗菌肽開(kāi)發(fā)利用產(chǎn)業(yè)化的必由之路，具有重要意義。而抗菌肽分子量小，重組表達(dá)時(shí)mRNA穩(wěn)定性差，而且抗菌肽本身對(duì)某些工程菌就具有抑殺作用，所以，如何構(gòu)建高表達(dá)工程菌也是個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種抗菌肽基因，該基因表達(dá)的抗菌肽抗菌譜廣，具有多種生物活性。

一種抗菌肽基因，堿基序列如SEQ?ID.No.1所示。該抗菌肽基因pxCA1是通過(guò)以下方法分離獲得的：

(1)將小菜蛾(Plutella?xylostella)幼蟲(chóng)飼養(yǎng)至4～7日齡，以針蘸取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的大腸桿菌對(duì)小菜蛾腹部進(jìn)行穿刺接種，繼續(xù)飼養(yǎng)24h后提取幼蟲(chóng)總RNA；

(2)對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA；

(3)以所述cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，即獲得所述小菜蛾抗菌肽基因；

所述引物的堿基序列為：

上游引物：5’-ATGAAACTGTCAAATATTTTCTTTTTC-3’；

下游引物：5’-CTATTTCCCGGCAGGTCTAGCG-3’。

所述抗菌肽基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯后得到的全長(zhǎng)肽段的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。該全長(zhǎng)肽段中，第1～22位氨基酸為信號(hào)肽，第23～24位氨基酸在翻譯后被切除，第25～65位氨基酸為成熟肽，即為本發(fā)明所述抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示。

為實(shí)現(xiàn)所述抗菌肽的大量表達(dá)，本發(fā)明對(duì)所述抗菌肽基因編碼序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，人工合成獲得了編碼所述抗菌肽的基因，以適應(yīng)具有不同密碼子偏好的工程菌。

本發(fā)明提供了兩種編碼抗菌肽的基因，其堿基序列分別如SEQ?ID?No.4和SEQ?ID?No.5所示；SEQ?ID?No.4所示的基因適合在大腸桿菌中表達(dá)，SEQ?ID?No.5所示的基因適合在酵母中表達(dá)。

本發(fā)明還提供了含有所述基因的重組表達(dá)載體，以及含有所述重組表達(dá)載體的重組工程菌。

本發(fā)明提供了兩種重組工程菌，其中，重組工程菌A的出發(fā)菌株為大腸桿菌，所述基因的堿基序列如SEQ?ID?No.4所示；重組工程菌B的出發(fā)菌株為酵母菌，所述基因的堿基序列如SEQ?ID?No.5所示。