[發(fā)明專利]一種殼聚糖磁性納米粒子固定普魯蘭酶的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410343479.9
• 申請(qǐng)日: 2014-07-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104099317A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金征宇;龍杰;焦愛(ài)權(quán);徐學(xué)明;謝正軍;田耀旗;周星;趙建偉;楊哪;王金鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N11/14
• 分類號(hào): C12N11/14;C12N11/10;B01J13/04
• 代理公司: 無(wú)錫華源專利事務(wù)所(普通合伙) 32228
• 代理人: 聶漢欽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種利用水凝膠誘導(dǎo)方法制備的殼聚糖磁性納米粒子來(lái)固定普魯蘭酶的新方法。

背景技術(shù)

普魯蘭酶（Pullulanase,?EC?3.2.1.41）是一種脫支酶，在以淀粉為原料的食品加工業(yè)中有著重要的用途，其能將最小單位的支鏈分解，最大限度的利用淀粉原料。目前在工業(yè)中主要是應(yīng)用在提高高葡糖漿及超高麥芽糖漿的產(chǎn)量和純度；提高啤酒糖漿的麥芽糖含量；增加馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、甘薯淀粉中抗消化淀粉的含量以及生產(chǎn)高直連淀粉等。

與游離的酶相比，固定化酶具有很多優(yōu)點(diǎn)，所以近幾十年來(lái)關(guān)于各種固定化酶技術(shù)和載體材料的研究應(yīng)運(yùn)而生。與傳統(tǒng)的材料相比，磁性納米顆粒是一種新型的復(fù)合材料，具有超順磁性及良好的生物相容性，使其在生物、醫(yī)藥和環(huán)保領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。用磁性納米顆粒為載體固定化酶，可實(shí)現(xiàn)在外加磁場(chǎng)下快捷的與產(chǎn)物分離，使工業(yè)化連續(xù)化生產(chǎn)成為可能，且分離比較徹底，簡(jiǎn)化了后續(xù)的產(chǎn)物分離過(guò)程，因此磁性納米顆粒作為載體固定化酶的研究成為生物催化領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

近年來(lái)，最普遍使用的磁性納米粒子是磁性四氧化三鐵納米粒子。然而，由于其自身的不穩(wěn)定性，它們?cè)谒芤褐腥菀装l(fā)生聚集，導(dǎo)致使用價(jià)值降低。研究表明，在磁性納米顆粒表面包裹一層生物相容性聚合物可以達(dá)到提高其穩(wěn)定性，減少聚集的作用。殼聚糖是除了纖維素、淀粉外生物界廣泛存在的第三大類生物相容性天然聚合物大分子，由于其無(wú)毒性，可降解性以及粘附性，引起了越來(lái)越多的關(guān)注，已應(yīng)用在金屬吸附、固定化酶、蛋白質(zhì)吸附和藥物的控制釋放等行業(yè)；并且殼聚糖表面還有大量功能性基團(tuán)，如氨基，羥基等，是進(jìn)行酶固定化的良好載體。研究報(bào)道已有一些酶固定在殼聚糖/四氧化三鐵納米顆粒上，并取得了較為理想的效果。

目前，磁性殼聚糖/四氧化三鐵納米粒子的合成主要是采用微乳液及乳液聚合法，但這些合成方法仍然存在工藝繁瑣，條件苛刻（較高溫度和壓力、需保護(hù)氣氛、有機(jī)溶劑和有機(jī)表面活性劑等）的問(wèn)題；并且這些合成方法大多是在水/油系統(tǒng)中進(jìn)行，然而由于大多數(shù)實(shí)際生產(chǎn)采用的是水系統(tǒng)，因此這也可能會(huì)限制其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本申請(qǐng)人提供了一種殼聚糖磁性納米粒子固定普魯蘭酶的方法。與傳統(tǒng)的固定化普魯蘭酶相比較，本發(fā)明首次采用殼聚糖水凝膠誘導(dǎo)法制備的載體用來(lái)固定化普魯蘭酶，較傳統(tǒng)方法步驟簡(jiǎn)單，條件溫和，為一種環(huán)境友好型的綠色方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種采用殼聚糖磁性納米粒子固定普魯蘭酶的方法，包括如下步驟：

（1）殼聚糖磁性納米粒子的制備；

（2）磁性納米粒子表面氨基化處理；

（3）氨基化處理后的磁性納米粒子與普魯蘭酶在交聯(lián)劑的存在下形成共價(jià)鍵，普魯蘭酶被固定。

具體步驟為：

（1）殼聚糖磁性納米粒子的制備方法：

將殼聚糖粉末加入到乙酸溶液中，配制成質(zhì)量百分比濃度為3~5%均一的淡黃色殼聚糖溶液；將濃度為25%的戊二醛溶液緩慢加入到上述殼聚糖溶液中，繼續(xù)勻速攪拌15~30min，再靜置12~24h，得到殼聚糖水凝膠；將水凝膠依次浸泡在0.05~0.2mol/L?Fe³⁺的水溶液、水、0.02~0.1mol/L?Fe²⁺的水溶液中，循環(huán)四次；然后將含有鐵離子的殼聚糖水凝膠浸泡在1~1.5?mol/L的NaOH?溶液中堿化處理12~24h，得到黑色的水凝膠，將此水凝膠采用乙酸及過(guò)氧化氫溶液水解即得到黑色的具有磁響應(yīng)的納米粒子，在外加磁場(chǎng)下收集磁響應(yīng)物質(zhì)，然后用蒸餾水漂洗至中性；所得到的磁性納米粒子分散性良好，直徑在5~12nm左右；

（2）磁性納米粒子表面氨基化處理的方法：

稱取已制備好的殼聚糖磁性納米粒子，于甲醇或甲苯溶液中超聲分散0.5~1.5?h，然后再將溶液調(diào)為堿性，在機(jī)械攪拌下緩慢加入硅烷偶聯(lián)劑，50℃下攪拌反應(yīng)4~8h；反應(yīng)后的產(chǎn)物用磁場(chǎng)收集，分別用無(wú)水乙醇和去離子水洗滌數(shù)次，洗滌過(guò)的固體在室溫下干燥，得到氨基化的殼聚糖磁性納米粒子；

（3）氨基化處理后的磁性納米粒子固定普魯蘭酶的方法：