[發(fā)明專利]一種茶毛蟲核型多角體病毒的定量檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410340772.X
• 申請日: 2014-07-17
• 公開（公告）號: CN104099429A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 肖強;袁志軍;付建玉;唐美君;葛超美
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州浙科專利事務(wù)所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

1.一種茶毛蟲核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

1）根據(jù)茶毛蟲核型多角體病毒的A13-1基因設(shè)計引物EupsNPV?A13-1?F和引物EupsNPV?A13-1?R，所述的引物EupsNPV?A13-1?F核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，所述的引物EupsNPV?A13-1?R核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示；

2）從感染茶毛蟲核型多角體病毒的蟲尸中提取茶毛蟲核型多角體病毒基因組DNA，獲取目的片段，以目的片段為模板，用步驟1)中設(shè)計的一對引物進行PCR擴增得到A13-1基因片段；

3）將步驟2）擴增獲得的A13-1基因片段與載體pGEM-T連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a中，挑單克隆菌株，搖菌，再采用PCR鑒定單菌落質(zhì)粒DNA，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒測序并測定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度，保存于-20℃冰箱中，備用，所述的重組質(zhì)粒核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示；

4）將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按梯度稀釋成不同濃度的模板，進行熒光定量PCR，以其模板數(shù)的對數(shù)值為X軸，CT值為Y軸做回歸曲線，建立檢測茶毛蟲核型多角體病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

5）提取待測樣品基因組，進行熒光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)步驟4）中建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測樣品的拷貝數(shù)，確定待測樣品的濃度。

2.如權(quán)利要求1所述的一種茶毛蟲核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于所述的步驟2）中PCR擴增的程序：先94℃預(yù)變性3min；然后94℃變性30s，?60℃變性45s；循環(huán)35次，最后延伸72℃延伸7min。

3.如權(quán)利要求1所述的一種茶毛蟲核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于所述的步驟4）中熒光定量PCR采用20ul體系：質(zhì)粒模板2μL，SYBR?Premix?Ex?TaqTM?(2×)?10μL，ROX?Reference?DyeⅡ?0.4μL，引物EupsNPV?A13-1?F和引物EupsNPV?A13-1?R各0.8μL，加滅菌雙蒸水6ul至20μL；反應(yīng)程序為：95℃?30s；95℃?5s，60℃?34s；共40個循環(huán)，陰性對照使用滅菌雙蒸水。

4.如權(quán)利要求1所述的一種茶毛蟲核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于所述的步驟4）中梯度為1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³和1.0×10²拷貝/μL。