[發(fā)明專利]一種快速檢測發(fā)酵液中蘇氨酸含量的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201410339765.8 | 申請日： | 2014-07-16 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN105319316B | 公開（公告）日： | 2019-04-02 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 張大偉;劉永飛;李斐然;姜文俠;張笑然;鄭平 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 |
| 主分類號(hào)： | G01N31/10 | 分類號(hào)： | G01N31/10 |
| 代理公司： | 上海一平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31266 | 代理人： | 馬莉華;崔佳佳 |
| 地址： | 300308 天津*** | 國省代碼： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 快速 檢測 發(fā)酵 中蘇 氨酸 含量 方法 | ||
1.一種檢測樣品中蘇氨酸含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
(i)將樣品與第一反應(yīng)溶液混合均勻，得到第一混合溶液；
(ii)將所述第一混合溶液置于4±1℃放置10-90min后恢復(fù)溫度至15-30℃；
(iii)將第一混合溶液與第二反應(yīng)溶液混合均勻得到第二混合溶液；
(iv)檢測所述第二混合溶液的OD340，每隔1-5分鐘檢測一次，共檢測5-7次；
(v)以檢測時(shí)間和對(duì)應(yīng)的OD340作圖，計(jì)算斜率即為樣品的OD340降低速率；
(vi)將計(jì)算得到的OD340的降低速率與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，得到所述樣品中蘇氨酸含量，
其中，所述第一反應(yīng)溶液含有HEPES buffer、NADH、PLP、乙醇脫氫酶、DTT和水；
所述第一混合溶液中含有10-500mM HEPES buffer、100μM-1000μM NADH、10μM-100μMPLP、1U-50U乙醇脫氫酶和0.5mM-8mM DTT；
所述第二反應(yīng)溶液中含有1-20U LTA，余量為水。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(i)中將樣品稀釋后與所述第一反應(yīng)溶液混合均勻，稀釋后的樣品中蘇氨酸的濃度為0.1-10mM。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，稀釋后的樣品與第一反應(yīng)溶液的體積比為1:1-5。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一混合溶液與所述第二反應(yīng)溶液的體積比為1-5:1。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過以下步驟獲得所述標(biāo)準(zhǔn)曲線：
(a)將濃度范圍為0.1mM～8mM的數(shù)個(gè)濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)蘇氨酸溶液分別與第一反應(yīng)溶液混合均勻，得到第一混合溶液；
(b)將所述第一混合溶液置于4±1℃放置10-90min后恢復(fù)溫度至15-30℃；
(c)將第一混合溶液與第二反應(yīng)溶液混合均勻得到第二混合溶液；
(d)檢測所述第二混合溶液的OD340，每隔1-5分鐘檢測一次，共檢測5-7次；
(e)以測定時(shí)間和對(duì)應(yīng)的OD340為坐標(biāo)作圖，計(jì)算斜率為OD340降低速率；
(f)以標(biāo)準(zhǔn)蘇氨酸溶液的濃度及對(duì)應(yīng)的OD340降低速率為坐標(biāo)，繪制得到所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，
其中，步驟(a)中所述第一反應(yīng)溶液含有HEPES buffer、NADH、PLP、乙醇脫氫酶、DTT和水；
步驟(a)得到的所述第一混合溶液中含有10-500mM HEPES buffer、100μM-1000μMNADH、10μM-100μM PLP、1U-50U乙醇脫氫酶和0.5mM-8mM DTT；
所述第二反應(yīng)溶液中含有1-20U LTA，余量為水。
6.如權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述第一混合溶液中含有50-400mMHEPES buffer、100μM～800μM NADH、20μM～80μM PLP、1U～35U乙醇脫氫酶和0.5mM～5mMDTT。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟a)中標(biāo)準(zhǔn)蘇氨酸溶液與第一反應(yīng)溶液的體積比為1:1-5；和/或
所述步驟c)中所述第一混合溶液與第二反應(yīng)溶液的體積比為1-5:1。
8.如權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述檢測樣品中蘇氨酸含量與所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立同時(shí)進(jìn)行。
9.如權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述LTA來源于銅綠假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、假絲酵母、念珠菌中的一種或兩種以上。
10.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(a)配制8個(gè)濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)蘇氨酸溶液，濃度分別為0.2mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM。
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