[發明專利]一種基于低場NMR實時檢測稀有細胞個數的方法

有效

• 申請號: 201410339279.6
• 申請日: 2014-07-16
• 公開（公告）號: CN104122286B
• 公開（公告）日: 2017-02-08
• 發明（設計）人: 張祥林
• 申請（專利權）人: 張祥林
• 主分類號: G01N24/08
• 分類號: G01N24/08
• 代理公司: 上海晨皓知識產權代理事務所(普通合伙)31260
• 代理人: 成麗杰

1.一種基于低場NMR實時檢測稀有細胞個數的方法，其特征在于，包含以下步驟：

(1)樣本制備

將純培養的目標稀有細胞，利用有限稀釋法以緩沖液進行細胞個數的梯度稀釋，制得系列濃度的稀有細胞懸浮液標準樣本；

對待測生物體液樣本進行Ficoll密度梯度離心，獲取候選混合細胞群，遞經洗滌高心重懸，制得目標稀有細胞懸浮液待檢樣本；

(2)免疫孵育前核磁共振弛豫時間檢測

取上述標準樣本，加入偶聯有目標稀有細胞特異表達抗體的核磁共振造影劑，混合均勻后立即用低場核磁共振分析儀進行弛豫時間測定，得弛豫時間值T₂⁰；

取上述待檢樣本，加入偶聯有目標稀有細胞特異表達抗體的核磁共振造影劑，混合均勻后立即用低場核磁共振分析儀進行弛豫時間測定，得弛豫時間值T₂^0’；

(3)免疫孵育中核磁共振弛豫時間檢測

取上述加入核磁共振造影劑的標準樣本，在恒溫下進行免疫孵育，每隔相同的時間間隔，用低場核磁共振分析儀測定一次核磁共振的弛豫時間T₂ⁿ，其中，n≥1，且n為整數；

取上述加入核磁共振造影劑的待檢樣本，在恒溫下進行免疫孵育，每隔相同的時間間隔，用低場核磁共振分析儀測定一次核磁共振的弛豫時間T₂^n’，其中，n≥1，且n為整數；

(4)標準樣本的免疫孵育時間-弛豫時間值標準曲線、免疫孵育時間-弛豫時間改變量標準曲線及孵育細胞數-弛豫時間改變量最大值曲線的制作

以標準樣本的孵育時間t為橫坐標，弛豫時間值T₂ⁿ為縱坐標，對每個細胞濃度梯度繪制免疫孵育時間-弛豫時間T₂ⁿ標準曲線；

計算標準樣本的弛豫時間改變量ΔT2，所述ΔT2＝T₂ⁿ-T₂⁰，以ΔT2為縱坐標，以免疫孵育時間t為橫坐標，對每個細胞濃度梯度繪制免疫孵育時間-弛豫時間改變量標準曲線，得到核磁共振造影劑與目標稀有細胞的最佳孵育時間；

以標準樣本的弛豫時間改變量ΔT2最大值為縱坐標，以標準樣本中的稀有細胞數個為橫坐標，制作孵育細胞數-弛豫時間改變量ΔT2最大值曲線，以檢測本方法的靈敏度；

(5)待檢樣本濃度得出

繪制最佳孵育時間下標準樣本的細胞數-弛豫時間改變量標準曲線；

計算最佳孵育時間下待檢樣本的弛豫時間改變量ΔT2_test，所述ΔT2_test＝T₂^n’-T₂^0’，根據ΔT2_test結合上述繪制的最佳孵育時間下標準樣本的細胞數-弛豫時間改變量標準曲線，得出待檢樣本中目標稀有細胞的個數和濃度。

2.根據權利要求1所述的基于低場NMR實時檢測稀有細胞個數的方法，其特征在于，所述的低場核磁共振分析儀內設有溫度控制設備，通過所述的溫度控制設備，控制免疫孵育的恒溫溫度。

3.根據權利要求1所述的基于低場NMR實時檢測稀有細胞個數的方法，其特征在于，步驟(2)中所使用的核磁共振造影劑優選為順磁性納米磁珠或超順磁性納米磁珠。

4.根據權利要求3所述的基于低場NMR實時檢測稀有細胞個數的方法，其特征在于，所述順磁性或超順磁性納米磁珠優選為抗EpCAM免疫納米磁珠、抗CD45免疫納米磁珠、鏈霉親和素納米磁珠、葉酸修飾的磁性脂質體中的一種或幾種。

5.根據權利要求1所述的基于低場NMR實時檢測稀有細胞個數的方法，其特征在于，所述步驟(2)和步驟(3)中，控制低場核磁共振分析儀的磁場強度為20～25MHz，磁體溫度為30～35℃，重復時間3～5s。

6.根據權利要求5所述的基于低場NMR實時檢測稀有細胞個數的方法，其特征在于，所述步驟(2)和步驟(3)中，控制低場核磁共振分析儀的磁場強度優選為20.18MHz，磁體溫度優選為35℃，重復時間優選為5s。