[發明專利]甲醛交聯/染色質免疫沉淀與分子克隆相結合篩選HSF靶DNA的方法

在審

• 申請號: 201410339027.3
• 申請日: 2014-07-16
• 公開（公告）號: CN104293909A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 郭麗紅;劉艷芳;蘇源;楊曉虹;陳子牛
• 申請（專利權）人: 昆明學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種甲醛交聯/染色質免疫沉淀與分子克隆相結合篩選HSF靶DNA的方法，其特征在于包括如下步驟：?

步驟一、熱激處理擬南芥幼苗；?

步驟二、甲醛處理使HSF與靶DNA共價交聯；?

步驟三、染色質免疫沉淀獲得HSF的靶DNA；?

步驟四、染色質免疫沉淀DNA經過銜接頭介導的PCR擴增后進行分子克隆及測序；?

步驟五、將測序結果在基因組數據庫中分析、鑒定靶DNA片段在基因組上的位置。?

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟一中，熱激處理擬南芥幼苗具體步驟為：?

取南芥幼苗放入培養緩沖液(SIB:0.5mMK₂HPO₄，0.5mMKH₂PO₄,pH6.0和0.1％蔗糖)39℃的水浴中震蕩培養30min。?

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟二中，甲醛處理使HSF與靶DNA共價交聯的具體步驟包括：?

將熱激處理和未處理的南芥幼苗，在室溫下浸入交聯緩沖液中(0.4mM蔗糖,10mM?Tris-HCl(PH8),1mMEDTA,1mMPMSF,1％甲醛),在真空下培養15min后加入終濃度為100mM甘氨酸在真空下培養5min以終止交聯反應；南芥幼苗用無菌去離子水沖洗后，凍入液氮中，于-70℃下保存。?

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟三中，染色質免疫沉淀獲得HSF的靶DNA的具體步驟包括：?

(1)破碎細胞?

(1.1)南芥幼苗加入3倍體積的裂解緩沖液1(50mMHEPES-KOH，pH7.5，140mMNaCl，1mMEDTA，1％TritonX-100，0.1％脫氧膽酸鈉，1mM?PMSF)在研缽中研磨(在液氮中進行)；然后轉移到10ml的離心管中；?

(1.2)超聲波切斷擬南芥基因組DNA，便其DNA片段化為100bp—600bp；超聲波振幅為60％，每次30s，共處理20次；?

(1.3)12000rpm，4℃，離心5min收集上清液并過0.22um孔徑的濾膜，濾液可直接進行染色質免疫共沉淀或液氮冷凍-70℃保存；?

(2)HSF抗血清與擬南芥細胞上清液共培養?

加60μlHSF抗血清于上述擬南芥細胞上清液中，4℃共培養4h；對照實驗中加等體積的PBS緩沖液；?

(3)封閉和洗滌蛋白A瓊脂糖膠?

在1.5mlEppendorf管中加入60μl50％懸浮的蛋白A瓊脂糖膠，每次以1ml裂解緩沖液1(50mMHEPES-KOH，pH7.5，140mMNaCl，1mMEDTA，1％TritonX-100，0.1％脫氧膽酸鈉，1mMPMSF)洗滌兩次，1000rpm，4℃，離心1min，收集蛋白A瓊脂糖膠；再加1ml1％BSA(溶于PBS)于上述蛋白A瓊脂糖膠中，4℃共培養6h封閉其非特異性位點；?

用1ml裂解緩沖液1洗封閉后的蛋白A瓊脂糖膠，1000rpm，4℃，離心1min，收集沉淀；重復洗滌一次，離心收集沉淀；?

(4)蛋白A瓊脂糖膠和抗體共溫育后的擬南芥細胞共培養?

蛋白A瓊脂糖膠沉淀轉入與抗體共溫育后的擬南芥細胞破碎液中，4℃冰浴培養30min—1h；1000rpm，4℃，離心1min，收集沉淀；?

(5)洗脫免疫沉淀DNA和蛋白質復合物?

(5.1)加1.4ml裂解緩沖液1于免疫沉淀DNA和蛋白質復合物中，置于4℃冰浴上洗脫5min；1000rpm，4℃，離心1min，收集沉淀；重復洗滌一次，離心收集沉淀；?

(5.2)加1.4ml裂解緩沖液2(50mMHEPES-KOH，pH7.5，500mMNaCl，1mMEDTA，1％TritonX-100，0.1％脫氧膽酸鈉，1mMPMSF)，在4℃冰浴上洗脫5min；1000rpm，4℃，離心1min，收集沉淀；重復洗滌一次，離心收集沉淀；?

(5.3)加1.4ml洗滌液(10mMTris-HCI，pH8.0，0.25MLiCl，0.5％NP-40，0.5％脫氧膽酸鈉，1mMEDTA)，在4℃冰浴上洗脫5min；1000rpm，4℃，離心1min，收集沉淀；將沉淀轉移到另一干凈的1.5ml?Eppendorf管中，重復洗滌一次，離心收集沉淀；?

(5.4)加1.4ml?TE緩沖液(10mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA)，在4℃冰浴上洗脫5min,1000rpm，4℃，離心1min，收集沉淀；?

(5.5)加40μl洗脫緩沖液(1％[w/v]SDSand0.1MNaHCO₃,pH7.5)于上述沉淀中，60℃?震蕩10min,洗脫HSF結合的DNA；12000rpm,4℃，離心1min，收集洗脫液；再加60μl洗脫緩沖液重復洗滌一次，離心收集洗脫液；?

(6)KlenowDNA聚合酶和蛋白酶K處理免疫沉淀DNA和蛋白質復合物?

在0.5ml的Eppendorf管中依次加入上述試劑和免疫沉淀復合物,混勻后并短暫離心，在25℃反應30min，75℃加熱10min；?

加入等體積(102μl)1mg/ml蛋白酶K(溶于50mMTris,10mMEDTA,0.3％SDS,pH7.5),60℃水浴過夜；?

(7)免疫沉淀DNA的分離純化?

1)向上述獲得的免疫沉淀DNA洗脫液中加入等體積的苯酚/氯仿(1:1)混合物，渦旋混勻；?

2)14000rpm離心3min，將上清轉至新的1.5ml離心管中；?

3)加等體積苯酚/氯仿(1:1)，混勻后14000rpm離心3min；?

4)取上清，加等體積氯仿抽提，14000rpm離心3min；?

5)上清轉至1.5ml離心管中；?

6)加1/10體積的醋酸鈉，2.5倍體積100％的乙醇及20μg糖元，-20℃，靜置過夜；?

7)14000rpm離心30min；?

8)去上清，用70％酒精洗沉淀；?

9)14000rpm離心30min；?

10)抽干，加入20μ1TE緩沖液(或無菌水)溶解沉淀，-20℃保存；?

(8)PCR分析免疫沉淀DNA?

(8.1)引物設計?

根據己發表的擬南芥熱激基因及非熱激基因的全基因序列分別設計HSP18.2啟動子區引物.?

AtHSP18.2/-229u:5’-ATTTTTCTTGGCATTTCAGG-3’?

AtHSP18.2/-243d:5’-GCATTTCGGTCTTGTTTCA-3’(52℃)?

(8.2)PCR反應?

反應體系如下：?

PCR擴增的參數為:94℃預變性5min，然后以94℃20s為變性參數，52℃20s為退火參數，72℃10s為延伸參數，循環數為25；經10％DNA聚丙烯酰氨凝膠分析PCR產物；?

(8.3)DNA-PAGE檢測PCR產物?

按以下配方配制凝膠:30％丙烯酰胺2.5ml,5xTBEbuffer(445mMTris,445mM硼酸,10rnMEDTA,pH8.0)750μl,100μ110％的過硫酸氨(APS)和5μl的TEMED；凝固后加入1xTBE電泳緩沖液淹沒凝膠的加樣孔；取10μ1PCR產物和2μl6xLoadingBuffer混合后點樣，在100V恒壓條件下電泳60min,EB染色2-3min后凝膠成像儀觀察并照相。?