[發明專利]一株枯草芽孢桿菌AP139及其發酵菌劑和它們的應用方法

有效

• 申請號: 201410337532.4
• 申請日: 2014-07-16
• 公開（公告）號: CN104099276A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發明（設計）人: 王升平;舒燕;劉惠知;周映華;郭照輝;胡新旭;高書峰;周小玲;繆東;曾發姣
• 申請（專利權）人: 湖南省微生物研究院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/00;A01P1/00;A23K1/17;C12R1/125
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所 43114
• 代理人: 袁靖

技術領域

本發明涉及微生物殺菌劑領域，更具體涉及一種枯草芽孢桿菌AP139及其發酵菌劑，同時還涉及它們在制備抑制巴氏桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌中的一種或幾種制劑中的應用。?

背景技術

多殺性巴氏桿菌是畜、禽、野生動物和人類的一種重要共患性病原，主要通過呼吸道傳播，可引起禽霍亂、豬肺疫和牛出血型敗血癥等，是養殖場一種非常常見的呼吸道傳染性疾病，在無抗生素使用的條件下發病率較高。巴氏桿菌在自然界中廣泛存在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中均有存在，養殖場環境中存在多種巴氏桿菌，空氣中一定滴度的巴氏桿菌在適宜的條件下致病。?

隨著畜禽養殖集約化和規模化程度不斷提高，養殖場空氣質量逐漸降低，巴氏桿菌引起動物發病的概率和損害程度不斷增加。目前，養殖場對巴氏桿菌引起的疾病進行控制主要通過抗生素進行預防和治療。然而，抗生素的大量使用引起內源性感染和二重感染、耐藥菌株的產生、畜禽免疫力下降和畜產品及環境中殘留引起二次污染等一系列嚴重問題，很多國家和地區比如歐盟和韓國都已經禁止使用抗生素。因此，如何在對人和環境影響較小或不影響的條件下，有效預防巴氏桿菌的感染與傳播，是一個急需解決的問題。?

本發明研制的枯草芽孢桿菌AP139及其發酵菌劑能抑制養殖舍中巴氏桿?菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的生長繁殖，尤其是巴氏桿菌，降低了養殖場由巴氏桿菌引起的發病率，具有良好的應用前景和重大的經濟及社會意義。?

發明內容

本發明的主要目的是在于提供一株枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)AP139及其發酵菌劑和它們的應用方法，該菌株及其菌劑能顯著的抑制養殖舍中巴氏桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌中的一種或幾種的生長繁殖，尤其是巴氏桿菌，降低了養殖場由巴氏桿菌引起的發病率。?

為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施：?

一株保藏編號為CCTCC?NO：M2014053的枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)AP139。?

所述的枯草芽孢桿菌AP139的發酵菌劑，是由以下方法制備而成的：?

第一步：所述的枯草芽孢桿菌AP139在LB固體培養基上進行劃線培養，培養溫度30-37℃，培養時間18-36h；?

第二步：從第一步的LB固體培養基上挑取枯草芽孢桿菌AP139單個克隆株至裝有20-40％容積LB液體培養基的10ml?EP管中，培養溫度為30-37℃，轉速為150-225r/min，培養時間18-36h；然后用LB液體培養基調整細菌濃度為1×10⁹-10¹⁰CFU/ml，取3-5ml接種于100mlLB液體培養基中，在搖床中進行培養，培養溫度30-37℃，轉速150-225r/min，培養時間18-36h；?

第三步：取第二步所得到的枯草芽孢桿菌AP139液體搖瓶培養液，按照3-5％體積接種量，接種到10L發酵罐中，發酵條件為：裝液量4-7L的LB液體培養?基，發酵溫度25-40℃，pH值6.8-7.8，發酵時間18-36h，轉速，200-400r/min。?

所述的枯草芽孢桿菌用于抑制巴氏桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌中的一種或幾種，優選用于抑制巴氏桿菌。?

所述的枯草芽孢桿菌用于制備抑制巴氏桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌中的一種或幾種的制劑，優選用于制備抑制巴氏桿菌的制劑。?

所述的枯草芽孢桿菌用于制備養殖舍消毒的制劑，或者動物飼料的添加劑。?

所述的枯草芽孢桿菌AP139的發酵菌劑也用于抑制巴氏桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌中的一種或幾種，優選用于抑制巴氏桿菌。?

所述的枯草芽孢桿菌AP139的發酵菌劑也用于制備抑制巴氏桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌中的一種或幾種的制劑，優選用于制備抑制巴氏桿菌的制劑。?

所述的枯草芽孢桿菌AP139的發酵菌劑也用于制備養殖舍消毒的制劑，或者動物飼料的添加劑。?

所述的枯草芽孢桿菌AP139的發酵菌劑的應用方法具體是將所述菌株的發酵菌劑先制備成1×10⁸-1×10⁹CFU/mL的溶液，LB液體培養基500-3000倍稀釋后在養殖舍中進行噴霧，使得噴霧后養殖舍枯草芽孢桿菌AP139的濃度為1×10⁵-1×10⁶CFU/m³。?