[發明專利]丙型肝炎病毒基因分型芯片及分型方法

有效

• 申請號: 201410336476.2
• 申請日: 2014-07-15
• 公開（公告）號: CN104263851B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發明（設計）人: 周有良;胡春凌;王海濤;陳峰;汪朝暉
• 申請（專利權）人: 周有良;胡春凌;王海濤;陳峰;汪朝暉
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識產權事務所(普通合伙)44248
• 代理人: 劉顯揚,黃曉笛

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，尤其是涉及一種丙型肝炎病毒基因分型芯片及分型方法。

背景技術

丙型肝炎病毒(Hepatitis?C?Virus，HCV)是引起輸血后非甲非乙型肝炎的主要元兇，全球感染率高達3％。HCV感染后，約有50％～80％轉為慢性感染，并有多達20％～30％在感染后20～30年后會發展為肝硬化及肝癌。HCV感染嚴重威脅人們的健康和生命，造成巨大的社會、經濟和醫療負擔，是一個嚴重的社會公共衛生問題。

HCV基因組呈高度異質性，至少可分為6個基因型(HCV1～6型)，有100多個基因亞型。準確鑒別HCV亞型，對于更好的了解HCV病毒進化，探討病毒的傳播途徑，選擇臨床治療方案，判斷病情變化，評價抗病毒治療效果，疫苗制備等具有非常重要的意義。

發明內容

本發明的目的之一在于設計一種能同時對丙型肝炎病毒基因分型的核酸液相芯片，所述芯片包括芯片載體，擴增引物及負載于芯片載體的探針核苷酸片段；所述引物及探針的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1至SEQ?ID?NO:8所示。

本發明的另一目的在于提供一種使用能同時分型的核酸液相芯片對丙型肝炎病毒基因進行分型的方法，所述方法采用的步驟為：

A)磁性羧基化熒光編碼微球包被核酸探針；

B)以合成的基因標準品質粒為模板建立和優化丙型肝炎病毒核酸液相芯片分型檢測方法；

C)提取樣本RNA，反轉錄成cDNA，進行丙型肝炎病毒核酸液相芯片分型。

本發明根據丙型肝炎病毒(HCV)的流行情況，針對HCV的六種亞型，包括1a、1b、2a、3a、3b和6a，建立能同時分型的核酸液相芯片檢測方法，能為丙型肝炎臨床分型檢測、分子流行病學調查等提供了一種新的檢測方法，為抗病毒治療方案的選擇提供參考依據。

附圖說明

圖1所示為丙型肝炎病毒(6a亞型)核酸液相芯片分型檢測方法的建立和優化實驗結果示意圖。

圖2所示為丙型肝炎病毒(1b亞型)核酸液相芯片分型檢測方法靈敏度實驗結果示意圖。

圖3所示為丙型肝炎病毒核酸液相芯片分型檢測方法的特異性實驗結果示意圖。

圖4所示為丙型肝炎病毒核酸液相芯片分型檢測方法檢測模擬混合感染樣品實驗結果示意圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例和附圖對本發明作進一步詳細說明。

材料

1.1.1標本來源2012年9月至2013年12月在中國人民解放軍100醫院和蘇州市第五人民醫院體檢、門診和住院的健康人群38例和抗-HCV陽性患者55例(41例為慢性肝炎、14例為肝硬化)，抗-HCV和HCV?RNA陽性患者病變程度的判斷依據2008年《丙型診斷標準WS2013》的診斷標準。其中，男性為59例，女性為34例，年齡為34-57歲，平均48.3歲。所有標本均采靜脈血2ml，分離血清，-70℃保存。

1.1.2主要試劑HCV-1a、1b、2a、3a、3b和6a基因標準品質粒(上海銳進生物技術有限公司)，磁性羧基化熒光編碼微球(Magnetic?COOH?Beads，美國Luminex公司，1.25×10⁷個/mL)，鏈霉親和素-藻紅蛋白(treptavidin,R-phycoerythrin?conjugate，SA-PE,1mg/mL，1mL，美國Invitrogen公司)，Shead?Fluid(美國Luminex公司)，PCR?Master?Mix(美國Fermentas)，1st?Strand?cDNA?Synthesis?Kit(日本Takara)。

1.1.3儀器設備液相芯片檢測系統(MAGPIX型，美國Luminex公司)，PCR儀(T100^TM，美國Bio-Rad公司)。

1.1.4引物和探針引物和探針均根據Genbank發表的E1基因序列，采用Primer?Primer5.0軟件設計而成。引物、探針核苷酸序列如表1所示。為了使PCR擴增產物生物素化，下游引物5’端進行了生物素標記。為了便于探針和羧基化微球進行偶聯反應，所有探針5’進行了C6氨基化修飾，同時為了保證探針與PCR產物的雜交效率，在探針的5’端添加了10個poly(T)，poly(T)作為間隔臂可有效減少空間位阻，有利于探針雜交反應的進行。引物和探針均由大連寶生物工程有限公司合成。