[發明專利]一種提高解淀粉芽孢桿菌生產鳥苷產量的方法

在審

• 申請號: 201410336004.7
• 申請日: 2014-07-15
• 公開（公告）號: CN104232674A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 廖瑜玲;謝暢豐;李紅;潘力;謝清華
• 申請（專利權）人: 廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司;華南理工大學
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N1/21;C12P19/40;C12R1/07
• 代理公司: 深圳市君盈知識產權事務所(普通合伙) 44315
• 代理人: 楊利娟

1.一種提高解淀粉芽孢桿菌生產鳥苷產量的方法，其特征在于包括如下步驟：嘌呤操縱子的啟動子部分片段即purE基因前-193～-29bp片段缺失；或是將purF基因的217位氨基酸亮氨酸突變為異亮氨酸。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述purE基因前-193～-29bp片段缺失，其DNA序列如SEQ?ID?NO:1所示。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述purF基因氨基酸序列217位突變，其DNA序列如SEQ?ID?NO:2所示。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述構建解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciensXH-Δpo：PCR擴增解淀粉芽孢桿菌DSM7菌株嘌呤啟動子基因的DNA片段，然后通過融合PCR將purE基因前-193～-29bp片段缺失，融合PCR擴增產物連接入pKS2質粒基因，最后將重組的pKS2質粒轉化入解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens?XH，經過同源重組，得到解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens?XH-Δpo；

所述構建解淀粉芽孢桿菌Bacillus?amyloliquefaciens?XH7-△po-purF-217：PCR擴增解淀粉芽孢桿菌DSM7菌株purF基因，然后通過融合PCR將purF基因217位氨基酸突變由原來的亮氨酸突變為異亮氨酸，融合PCR擴增產物連接入pKS2質?；颍詈髮⒅亟M的pKS2質粒轉化入解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciensXH-Δpo，經過同源重組，得到解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens?XH7-△po-purF-217。

5.利用權利要求4所得解淀粉芽孢桿菌工程菌生產鳥苷的方法，其特征在于包括以下步驟：將解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens?XH7-△po-purF-217在37℃的固體活化培養基中培養24～36h，得到活化的解淀粉芽孢桿菌Bacillus?amyloliquefaciens?XH7-△po-purF-217；然后將活化的解淀粉芽孢桿菌Bacillus?amyloliquefaciens?XH7-△po-purF-217以單菌落接入搖瓶種子培養基，37℃培養6～7h，按體積比10％的接種量接種到搖瓶發酵培養基中，37℃發酵60～72h，將發酵液加熱、離心，將上清液過0.22μm的膜HPLC檢測鳥苷含量。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述固體活化培養基成分(重量百分比)：1％蛋白胨，1％氯化鈉，0.5％酵母抽提物，1％葡萄糖，1.5％瓊脂，余量為水；搖瓶種子培養基成分(重量百分比)：葡萄糖1.5％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl0.5％，余量為水，pH7.2；搖瓶發酵培養基成分(重量百分比)：葡萄糖8％，硫酸鎂0.6％，酵母粉0.8％，硫酸二氫鉀0.15％，硫酸銨1.0％，氯化鉀0.15％，味精1.6％，碳酸鈣0.3％，余量為水，pH7.2。