[發(fā)明專(zhuān)利]尤韋可擬盤(pán)多毛孢代謝產(chǎn)物在防治獼猴桃褐腐病菌中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410335930.2
• 申請(qǐng)日: 2014-07-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104161049A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-11-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 錢(qián)一鑫;康冀川;耿坤
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 貴州大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): A01N63/04
• 分類(lèi)號(hào): A01N63/04;A01P3/00
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 谷慶紅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一株來(lái)源于藥用植物牡蒿的擬盤(pán)多毛孢屬內(nèi)生真菌尤韋可擬盤(pán)多毛孢(Pestalotiopsis?uvicola)GMH31代謝產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

植物內(nèi)生真菌(fungal?endophyte)是指生活史的一定階段或全部階段生活與健康植物各組織合格器官內(nèi)的真菌。它們與宿主植物通過(guò)互作形成了緊密的共生關(guān)系，可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，提供植物應(yīng)對(duì)脅迫的適應(yīng)能力，有的植物內(nèi)生真菌還具有藥用價(jià)值。從植物內(nèi)生真菌中尋找和發(fā)現(xiàn)活性化合物已成為國(guó)內(nèi)外研究的又一熱點(diǎn)。如中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN201310194836.5公開(kāi)了一株龍膽中分離得到的內(nèi)生真菌(Metarrhizium)LD421，可用于防治龍膽葉枯病；專(zhuān)利申請(qǐng)CN201210067829.4則公開(kāi)了從銀杏根、莖、葉等組織中分離得到的內(nèi)生真菌腐皮鐮孢菌T-7，對(duì)辣椒疫霉病菌、番茄枯萎病菌、蘋(píng)果腐爛病菌等具有很好的抑制作用。?

牡蒿(Artemisia?japonica)為菊科蒿屬植物，其味苦、微甘、性涼。民間又稱(chēng)土紫胡(《陸川草本》)、胃痛靈、熊掌草，以全草入藥。具有清熱、涼血、解毒、健胃止血功效，主要用于治療感冒發(fā)熱，中暑、瘧疾、肺結(jié)核潮熱、高血壓病、五癆七傷、大小便不通和毒蛇咬傷等。同時(shí)也有記載牡蒿為藥食兩用植物，含有多種活性物質(zhì)，具有免疫、抗病毒、抗腫瘤、降血糖、降血脂保肝以及延緩衰老等多種生理功能。另外，牡蒿還可用于制備生物農(nóng)藥，作為殺蟲(chóng)劑使用。?

目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中控制農(nóng)作物病蟲(chóng)草害的主要手段是化學(xué)農(nóng)藥防治，其對(duì)減輕病蟲(chóng)草害，保證農(nóng)作物豐產(chǎn)豐收起到積極的作用，但是由于自然界生物之間的相互制約相互依存，現(xiàn)在已不建議過(guò)分依賴(lài)化學(xué)農(nóng)藥在進(jìn)行病害的處理。因此，對(duì)植物內(nèi)生真菌的研究，利用植物內(nèi)生真菌與宿主植物生物活性共生的關(guān)系，來(lái)篩選具有高生物活性的內(nèi)生真菌，進(jìn)一步獲得活性產(chǎn)物，是今年來(lái)研究的一大?熱點(diǎn)。但是，對(duì)于某一宿主植物，究竟何種內(nèi)生真菌或哪幾類(lèi)內(nèi)生真菌具有抗病原微生物活性，且各內(nèi)生真菌中哪種菌活性最高，分離純化是否容易，發(fā)酵過(guò)程是否復(fù)雜等等，都是需要進(jìn)行大量研究加以證實(shí)的，目前尚未發(fā)現(xiàn)牡蒿內(nèi)生真菌及其分離培養(yǎng)和抗病原微生物活性、藥用活性應(yīng)用的具體報(bào)道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)化學(xué)藥品不安全與微生物源藥品種類(lèi)較少的不足，提供一種從藥用植物牡蒿中分離篩選出的內(nèi)生真菌——尤韋可擬盤(pán)多毛孢(Pestalotiopsis?uvicola)。?

本發(fā)明所述內(nèi)生真菌，是從貴州省貴陽(yáng)市郊區(qū)的藥用植物牡蒿(Artemisia?japonica)中分離獲得的，命名為內(nèi)生尤韋可擬盤(pán)多毛孢(Pestalotiopsis?uvicola)GMH31，并對(duì)該菌株的發(fā)酵代謝產(chǎn)物進(jìn)行了多種生物活性研究。該發(fā)明為微生物源農(nóng)藥和醫(yī)藥的進(jìn)一步研制和開(kāi)發(fā)提供優(yōu)良的出發(fā)菌株。?

本發(fā)明技術(shù)方案如下：?

本發(fā)明尤韋可擬盤(pán)多毛孢的分離、篩選與鑒定：?

是于2011年8月在貴州省貴陽(yáng)市郊區(qū)采集的牡蒿葉片中，經(jīng)分離、純化、培養(yǎng)、發(fā)酵和活性測(cè)定等步驟獲得并保存；經(jīng)微生物分類(lèi)學(xué)鑒定為尤韋可擬盤(pán)多毛孢(Pestalotiopsis?uvicola)，定名為尤韋可擬盤(pán)多毛孢(Pestalotiopsis?uvicola)GMH31。該菌株已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日期2014年6月30日，保藏登記號(hào)CCTCC?NO:M2014303，地址湖北省武漢市武昌珞珈山。?

具體的分離培養(yǎng)方法為：?

(1)牡蒿植物組織的準(zhǔn)備：采集牡蒿的葉組織，用自來(lái)水沖洗，除去樣品表面的表生微生物，然后放于干凈的紗布上風(fēng)吹晾干；?

(2)表明消毒及無(wú)菌檢測(cè)：晾干后的組織塊剪成適宜大小，用滅菌蒸餾水沖洗干凈，葉片消毒采用75％乙醇浸泡1-2min、0.1％HgCl₂溶液浸泡3-4min，然后用滅菌蒸餾水沖洗至消毒液無(wú)殘留，用滅菌濾紙吸干組織段表面殘留水滴后，切成直徑4～6mm大小的組織切段；?

(3)內(nèi)生真菌的分離純化：將步驟(2)消毒后的組織切段接種于含有硫酸鏈霉素(100μg·mL^-1)和青霉素(50μg·mL^-1)的PDA培養(yǎng)基平板上，封口后于25-30℃恒溫培養(yǎng)2～7天，至菌絲體從組織塊中長(zhǎng)出，采用尖端菌絲挑取法，將菌絲轉(zhuǎn)移至?純化PDA培養(yǎng)基平板上，于25-30℃下進(jìn)行純化培養(yǎng)5～9天，長(zhǎng)出完整菌落，即為牡蒿內(nèi)生真菌。?