[發明專利]一種集樣PCR檢測HBV的試劑盒及應用

在審

• 申請號: 201410335139.1
• 申請日: 2014-07-15
• 公開（公告）號: CN105274251A
• 公開（公告）日: 2016-01-27
• 發明（設計）人: 佘銳萍;趙月;肖鵬;毛晶晶;楊依霏;石蕊寒;陳建
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種集樣PCR檢測HBV的試劑盒及應用。

背景技術

乙型肝炎(HB)是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種以肝臟損傷為主要特征的嚴重危害人類和動物健康的傳染病之一。HBV屬于嗜肝病毒科成員，迄今為止，發現的嗜肝DNA病毒科有感染哺乳動物的正嗜肝病毒，可感染人和猩猩等哺乳動物，在黑猩猩、長臂猿、地松鼠和樹鼩等動物中均有發現；而另一類感染禽類和鳥類的禽是肝病毒屬在北京鴨、雪雁和蒼鷺等也均有發現。值得注意的是，近年來，有研究報道在鸚鵡、蝙蝠以及屠宰豬和雞中也陸續發現了類HBV的存在。新的動物種屬中HBV的發現表明HBV病毒可能出現變異或重組、宿主范圍正日益擴大，對人類的健康具有威脅性。因此，對HBV在動物中的流行情況進行調查具有十分重要的意義。

目前已有酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測試劑盒投入市場，可用于血清學流行病學調查。但對病毒的檢測，目前只能采用常規的PCR法進行檢測?，F有的PCR檢測法雖然具有靈敏、快速、準確的優點，但在進行大量樣品檢測時，存在樣品處理費時、費力，操作繁雜，且浪費試劑等缺陷，尤其是對于那些陽性率比較低的樣品篩查，亟待對其進行優化。

目前，HBV流行病學調查主要依賴ELISA試劑盒進行血清學診斷，但此方法僅可在血清學水平對HBV進行調查，不能反映病毒在動物體內的存在情況。同時，在樣品量較大時，血清的處理和保存也成為制約ELISA檢測準確性和穩定性的因素之一。此外，由于試劑盒本身的批次和廠家不同，其重復性和穩定性也受到影響，商品化的試劑盒在成本方面也不具有優勢。

發明內容

本發明的目的是提供一種鑒定或輔助鑒定多個待測樣本中哪些樣本感染乙型肝炎病毒的試劑盒。

本發明提供的試劑盒，包括單獨使用的引物對A、單獨使用的引物對B和記載PCR擴增方法的載體；

或包括含有所述引物對A的PCR試劑、含有所述引物對B的PCR試劑和所述記載PCR擴增方法的載體；

所述引物對A由序列表序列1所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成；

所述引物對B由序列表序列3所示的單鏈DNA和序列表序列4所示的單鏈DNA組成；

所述PCR擴增方法包括如下步驟：

1)將多個待測樣本分為n組，且將每組中各待測樣本等質量混合得到混合樣本，每組待測樣本數相同，提取每組所述混合樣本的基因組DNA；

2)以每組所述混合樣本的基因組DNA為模板，用所述引物對A進行第一次PCR擴增，得到第一次PCR擴增產物；

3)以所述第一次PCR擴增產物為模板，用所述引物對B進行第二次PCR擴增，得到每組待測樣本的第二次PCR擴增產物；檢測每組待測樣本的第二次PCR擴增產物，選取PCR擴增產物具有大小為281bp片段的待測樣本組；檢測每組待測樣本的第二次PCR擴增產物的方法為電泳檢測；

4)將所述PCR擴增產物具有大小為281bp片段的待測樣本組中的每個待測樣本分別提取基因組DNA，分別重復步驟2)和3)，得到每個待測樣本的第二次PCR擴增產物；

檢測每個待測樣本的第二次PCR擴增產物，若第二次PCR擴增產物具有大小為281bp片段，則該待測樣本感染或候選感染HBV病毒；若第二次PCR擴增產物不具有大小為281bp片段，則該待測樣本未感染或候選未感染HBV病毒。

上述試劑盒中，所述載體為說明書。上述方法中，檢測每個待測樣本的第二次PCR擴增產物的方法為電泳檢測或測序檢測；

上述試劑盒中，所述含有所述引物對A的PCR試劑由PCR擴增緩沖液、所述引物對A和水組成；

所述含有所述引物對B的PCR試劑由PCR擴增緩沖液、所述引物對B和水組成。

上述試劑盒中，所述引物對A和所述引物對B中的各條引物均為等摩爾混合；

所述引物對A和所述引物對B中的各條引物在其所在所述PCR試劑中的濃度均具體為0.4μM。

上述的試劑盒或由所述引物對A和所述引物對B組成的引物組或由所述含有所述引物對A的PCR試劑和所述含有所述引物對B的PCR試劑組成的PCR試劑組在制備鑒定或輔助鑒定多個待測樣本中哪些樣本感染乙型肝炎病毒的產品中的應用也是本發明保護的范圍。

上述樣本為離體動物組織或血清或膽汁；所述組織具體為肝臟。