[發明專利]靶向抑制Mus81基因表達的siRNA、siRNA質粒、干擾慢病毒及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 201410335062.8
• 申請日: 2014-07-14
• 公開（公告）號: CN104164435A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 吳帆;劉建偉;戴麗冰
• 申請（專利權）人: 吳帆
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N15/66;A61K48/00;A61P35/00;A61P1/16
• 代理公司: 廣州廣信知識產權代理有限公司 44261
• 代理人: 李玉峰

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及靶向抑制Mus81基因表達的siRNA、siRNA質粒、干擾慢病毒及其構建方法以及在制備治療肝癌藥物中的應用。

背景技術

Mus81基因屬于XPF核酸內切酶超家族，最早由Interthal?H等于2000年首先在酵母菌中鑒定得到，因敲除該基因的酵母菌對乙烷磺酸鹽和紫外線更敏感，Interthal?H等稱其為“對乙烷磺酸鹽及紫外線敏感的第81號獨立序列”(MMS?and?UV?sensitive?isolate?number81，Mus81)。Chen?XB等隨后于2001年鑒定得到人Mus81基因，該基因定位于人11號染色體的長臂(11q13.1)，共包含16個外顯子，其編碼的Mus81蛋白具有兩個可與DNA分子結合的螺旋-發卡-螺旋結構，在這二者之間有一個典型的XPF樣核酸內切酶結構域。Mus81蛋白通過其N末端定位于細胞核內，利用其C末端與另一核酸內切酶Eme1結合形成異源二聚體而發揮作用，并具有與檢查點激酶Cds1等多種蛋白相結合的位點。Mus81基因憑借其核酸內切酶的功能，在細胞有絲分裂、修復DNA雙鏈斷裂和維護基因穩定性中發揮了關鍵作用。

目前，現有技術通過動物胚胎干細胞和動物實驗表明，Mus81在腫瘤的發生發展中可以發揮抑癌基因的作用。研究表明，敲除一個等位基因的Mus81^+/-小鼠或兩個等位基因均被敲除的Mus81^-/-小鼠與野生型(Mus81^+/+)小鼠相比，73％的Mus81^-/-小鼠在1年內死于淋巴瘤、乳腺癌及卵巢癌等各種自發性腫瘤，部分小鼠體內甚至同時發生了兩種以上的腫瘤，而野生型小鼠在此期間則幾乎全部(95％)健康存活。最近研究也發現，p53缺失的小鼠只要再損失一個Mus81等位基因，其發生肉瘤的幾率立即顯著上升，表示Mus81和p53在腫瘤抑制中可能具有協同效應。此外，新近的研究顯示，缺失Mus81基因的小鼠胚胎干細胞和小鼠均對順鉑和絲裂霉素敏感，而重新導入Mus81基因后，它們對順鉑和絲裂霉素的敏感性就明顯下降，鑒于順鉑、絲裂霉素均是目前常用的腫瘤化療藥物，表明Mus81作為一個DNA損傷修復關鍵基因，其與腫瘤化療藥物敏感性的調控關系密切。

如上所述，Mus81之前的研究對象多為胚胎干細胞(如小鼠胚胎干細胞)和動物(如小鼠)，尚無有關抑制Mus81基因表達對人肝癌細胞的生長、增殖、凋亡等的影響，以及Mus81基因可否調控肝癌細胞化療敏感性等的研究報道；而且，目前抑制Mus81基因的方法也多是基因敲除，該方法研究周期長、對技術條件的要求高且難以應用于臨床治療，因而存在明顯的局限性。核糖核酸干擾(RNA?interference，RNAi)是近年來興起的一種基因沉默技術，長度為21-23個核苷酸組成的短的雙鏈核糖核酸(dsRNA)能夠在轉錄及轉錄后水平特異性地引起基因沉默，因其可簡便、高效、特異地阻斷體內特定基因的表達，使細胞表現出相應基因表型的缺失，從而得到了廣泛的應用。目前，該技術在基因功能研究、腫瘤的基因治療及新藥的研究與開發等方面已顯示出廣闊的前景。特定的由21個堿基組成的小干擾核糖核酸(short?interfering?RNA，siRNA)是RNAi的主要效應物，但由于siRNA片段的半衰期過短，體外合成的siRNA片段轉移到細胞內后，其發揮出的基因抑制作用一般是很短暫的。因此，臨床研究中一般采取事先在體外構建能夠表達siRNA片段的載體，再將載體轉移至細胞內使其表達出siRNA片段的策略。目前常用的載體包括逆轉錄病毒、腺病毒和慢病毒。慢病毒表達載體相對于其它表達載體，具有免疫原性低、感染效率高、感染時間長、感染效果穩定且能感染分裂相和非分裂相細胞等優點，已成為腫瘤治療領域中應用技術研發的強有力手段。RNAi基因沉默功能的實現依賴于siRNA序列的選擇與高效表達載體的構建，目前，現有技術尚無靶向抑制Mus81基因表達的siRNA、siRNA質粒、干擾慢病毒及其在制備治療肝癌藥物中的應用。

發明內容