[發明專利]結合半乳糖的凝集素及其診斷類風濕性關節炎的應用

有效

• 申請號: 201410334550.7
• 申請日: 2014-07-15
• 公開（公告）號: CN104130323A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 燕秋;富力;張文利;李盛;馬悅
• 申請（專利權）人: 大連醫科大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/12;C12N5/078;C12P21/02;G01N33/68
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責任公司 21101
• 代理人: 王勇

技術領域

本發明屬于生物醫學技術領域，具體而言，本發明提供了結合半乳糖的凝集素及其在制備早期診斷類風濕性關節炎的試劑盒中的應用等。?

背景技術

???????類風濕性關節炎(rheumatoid?arthritis，RA)是以關節進展性破壞為主、并累及其他多種臟器的常見病，其發病率可高達5％。RA的病情特點為反復發作，呈進展性加重，如從關節晨僵、紅腫到關節破壞，及使病人喪失活動能力等。類風濕關節炎被稱為“不死的癌癥”，它給病人帶來了極大的身心痛苦和經濟負擔。類風濕關節炎如能在早期予以正確診斷并合理治療，病情將可得到緩解或趨于穩定。?

目前類風濕關節炎現常用的診斷方法有實驗室檢測和X-光片方法等。其中實驗室檢測方法主要包括IgG、類風濕因子(RF)、血沉、C-反應蛋白測定等。但是這些方法各有不足之處：IgG測定是病人血中總IgG水平的測定，不同人IgG水平變化范圍較大，且免疫功能低下的病人并不伴有IgG升高；血沉和C-反應蛋白是反映病情活動期的一個指標，在多種疾病可有不同程度的升高，如結核、血液病和炎癥等；類風濕因子出現較晚，并且僅有30-40％的病人為陽性，并同時受總IgG水平的影響；X-光片診斷是依據骨關節密度等診斷類風濕關節炎的指標，當類風濕關節炎病人出現骨改變時有意義，它也只能是一個較晚期出現的指標。?

然而，本發明人在長期研究RA診斷的過程中，令人意外地發現了一種具有結合半乳糖能力的凝集素，其不但具有更強的促胸腺細胞凝集的作用，能夠與游離的半乳糖更完全地結合，而且能夠與糖蛋白（如人IgG）的糖鏈中暴露出來的半乳糖等非游離的半乳糖結合，特別適合在ELISA（酶聯免疫吸附測定）診斷類風濕性關節炎的方法中應用。?

發明內容

本發明要解決的技術問題在于提供新的凝集素，其具有結合半乳糖的能力，其中半乳糖無論是游離的，還是處于諸如糖蛋白的糖鏈中的，和/或，其具有凝集胸腺細胞的能力。另外，本發明還提供了該凝集素的編碼核酸、載體、細胞和制備方法以及其應用，包括制備凝集胸腺細胞或者結合半乳糖的試劑的應用和制備用于診斷類風濕性關節炎的方法的試劑盒的應用等。?

具體而言，在第一個方面，本發明提供了凝集素，其具有的氨基酸序列：?

（1）如SEQ?ID?NO：1所示；或，

（2）是在如SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列上缺失、取代和/或添加一個或幾個氨基酸而獲得的氨基酸序列，而且其具有結合半乳糖的能力或者仍舊具有凝集胸腺細胞的能力。

本發明的第一個方面的凝集素的氨基酸序列可以是在如SEQ?ID?NO：1所示的序列的基礎上添加、缺失和/或取代一個或幾個(優選一個至五個，更優選一個至三個)氨基酸殘基而得的氨基酸序列，并且仍舊具有結合半乳糖的能力，如結合游離的半乳糖和/或結合糖蛋白的糖鏈中的半乳糖，或者仍舊具有凝集胸腺細胞的能力。本領域技術人員知曉，通過改變已知多肽的編碼基因序列并將其導入表達載體，可以制備出取代、添加或缺失了氨基酸殘基的多肽，這些方法廣泛記載于《分子克隆實驗指南》(北京：科學出版社，2002年)等本領域公知的文獻中。在取代的氨基酸殘基中，優選取代為與原氨基酸殘基側鏈性質相似的其他氨基酸，從而更得以保持原有功能活性。側鏈性質相似的氨基酸分別有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族側鏈的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羥基側鏈的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子側鏈的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺側鏈的氨基酸(D、N、E、Q)、含堿性基團側鏈的氨基酸(R、K、H)、含芳香族側鏈的氨基酸(H、F、Y、W)。在本發明的第一個方面中，優選所述凝集素的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。?

在第二個方面，本發明提供了編碼本發明第一個方面所述的凝集素的核酸。本發明的核酸，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，優選DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA?可以是編碼鏈或模板鏈。通過常規技術，如PCR方法、重組法或人工合成的方法，本領域技術人員可以很容易獲得本發明的核酸或其片段。這些序列一旦獲得，就可以將其克隆入載體，再轉化或轉染入相應的細胞，然后通過常規的宿主細胞進行增殖，從中分離得到大量的核酸分子。優選本發明的核酸分子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。該優選序列優化了在大腸桿菌的表達，使得在大腸桿菌BL21?(DE3)中的表達比例可以占到總蛋白的20%。?