[發(fā)明專利]一種用于核酸快速提取的工具盒、試劑盒及核酸提取方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410333527.6
• 申請(qǐng)日: 2014-07-14
• 公開（公告）號(hào): CN104073429B
• 公開（公告）日: 2017-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃留玉;劉威;袁靜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍疾病預(yù)防控制所
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12M1/00
• 代理公司: 北京尚誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11322
• 代理人: 魯兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可以從各種臨床樣本中快速提取核酸的工具盒、試劑盒及從臨床樣本中快速提取核酸的方法。

背景技術(shù)

(一)核酸提取

核酸提取已經(jīng)成為了分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的最重要、最基本的操作，但是目前核酸的提取方案非常之多，而且繁簡不一。分子診斷、核酸測序、功能基因組等相關(guān)實(shí)驗(yàn)的完成全部依賴核酸的成功提取，傳統(tǒng)的操作流程己經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)全部的自動(dòng)化，但這些昂貴的儀器并不能得到大規(guī)模的推廣使用，我國目前仍是發(fā)展中國家，廣大的基層醫(yī)療單位并不能配備復(fù)雜的儀器，因此，提供一種經(jīng)濟(jì)性好的核酸提取裝置很有必要。

核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在，核酸提取的主要步驟為：一、裂解細(xì)胞，去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子時(shí)，應(yīng)去除RNA，反之亦然，如果是提取RNA和DNA共提取的話，則不需去除任何一種；二、沉淀核酸或者吸附核酸；三、純化核酸，去除鹽類，有機(jī)劑等雜質(zhì)；四、洗脫或溶解核酸，利用洗脫液或者溶解液將核酸洗脫或者溶解。

(二)臨床樣本前處理

由于樣本的處理及保存對(duì)DNA和RNA(尤其是RNA)的影響較大，因此在核酸測定時(shí)標(biāo)本的處理及適當(dāng)保存對(duì)測定結(jié)果的準(zhǔn)確有效非常重要。臨床常見的標(biāo)本有血清(漿)、全血、分泌物、棉拭子、膿液、體液、新鮮組織、石蠟切片等，這些臨床標(biāo)本的處理方法各有不同。

1.血清(漿)標(biāo)本

加適量的紅細(xì)胞裂解液(破膜液)，裂解全血中的紅細(xì)胞；再加適量的細(xì)胞核裂液(破核液)，裂解白細(xì)胞中的細(xì)胞核，使核內(nèi)DNA釋放出來；然后再加SDS(十二烷基硫酸鈉)等去污劑，溶解脂蛋白，解聚核蛋白；SDS可與蛋白質(zhì)結(jié)成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性沉淀，但SDS在以后的核酸提取過程中必須除去。

2.痰標(biāo)本

痰屬于分泌物，臨床上常用作結(jié)核桿菌DNA測定樣本，由于痰標(biāo)本中含大量粘蛋白和雜質(zhì)，故在核酸提取時(shí)，一定要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行前處理，即用4％NaOH液化，去除粘蛋白，然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等經(jīng)典法提取DNA。

3.棉拭子

用PCR方法檢測性病病原體時(shí)(衣原體、支原體、淋球菌、梅毒螺旋體、人乳頭狀瘤病毒等)，臨床標(biāo)本一般為棉拭子。標(biāo)本取材是關(guān)鍵，衣原體等病原體感染上皮細(xì)胞，因此取材一定要取到細(xì)胞。具體方法：

加1ml無菌生理鹽水，充分震蕩混勻，12000rpm，離心5分鐘

用棉拭子取尿道分泌物或?qū)m頸分泌物(由醫(yī)護(hù)人員采集)，置無菌試管或EP管內(nèi)棄上清，沉淀加無菌生理鹽水1ml，打勻，12000rpm，離心5分鐘

4.體液

體液標(biāo)本，包括胸水、腹水、腦脊液、尿液等，可直接離心，取沉淀物提取核酸。血性胸腹水，可使用紅細(xì)胞裂解液處理：

5.膿液

粘稠膿液：同痰標(biāo)本處理，先用4％NaOH液化，再離心取沉淀提取DNA。

水樣膿液：直接離心，沉淀用生理鹽水洗2-3次后用于DNA提取。

6.組織

組織有新鮮組織和石蠟切片。新鮮組織的處理步驟：先用生理鹽水洗二次，然后將其搗碎或剪碎(用眼科剪)，加蛋白酶K消化后提取核酸；石蠟切片用于核酸提取，需先用二甲苯脫蠟，再用蛋白酶K消化后進(jìn)行DNA提取。

(三)核酸提取工具及試劑盒

核酸提取已經(jīng)成為了分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的最重要、最基本的操作，但是目前核酸的提取方案非常之多，而且繁簡不一。分子診斷、核酸測序、功能基因組等相關(guān)實(shí)驗(yàn)的完成全部依賴核酸的成功提取，傳統(tǒng)的操作流程已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)全部的自動(dòng)化，但這些昂貴的儀器并不能得到大規(guī)模的推廣使用，我國目前仍是發(fā)展中國家，廣大的基層醫(yī)療單位并不能配備復(fù)雜的儀器，因此，提供一種經(jīng)濟(jì)性好的核酸提取裝置很有必要。

CN101684463A提出一種微量臨床樣本核酸快速提取裝置，由尖口吸管、帶膜的過濾器和抽吸裝置(注射器或塑料泡)三部分組成，其通過三次抽吸完成核酸吸附、清洗及洗脫過程，能快速簡便從樣本中提取核酸，然美中不足的是，尖口吸管、帶膜的過濾器和抽吸裝置三部分組合方式單一且為固定安裝，用塑料泡做抽吸裝置時(shí)(CN101684463A的圖2、圖3)第三次抽吸進(jìn)行核酸洗脫實(shí)際不能完成(前兩次抽吸的廢液無法排出，帶核酸的洗脫液混在廢液中)，而使用注射器做抽吸裝置時(shí)，帶核酸的洗脫液進(jìn)入注射器不僅會(huì)沾染注射器形成生物垃圾，還會(huì)導(dǎo)致微量樣本中核酸備注射器沾染而損失致使檢測不準(zhǔn)確。