[發明專利]生物工程菌株及其制備方法和用途

在審

• 申請號: 201410333085.5
• 申請日: 2014-07-14
• 公開（公告）號: CN104293692A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 許煜泉;劉海明;周泉;周萬平
• 申請（專利權）人: 武漢漢申生物科技有限責任公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/01;C12P17/12;C12R1/38
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

技術領域

本發明屬于微生物源農藥生產技術領域，尤其涉及一種改進的用于生產新型微生物源殺菌劑的工程菌株的制備及其應用。具體地，本發明涉及生物工程菌株、制備生物工程菌株的方法、生物工程菌株在制備吩嗪-1羧酸中的用途以及制備吩嗪-1-羧酸的方法。

背景技術

生物農藥促生拮抗菌M18，屬于一種產熒光的假單胞菌，對植物病害具有高效、安全、廣譜的殺菌作用，易于在環境中解體，與環境相容性好。該促生拮抗菌M18已于2000年6月27日在中國專利局指定的保藏單位：北京，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC?NO.0462。生物農藥促生拮抗菌M18的制備和應用，已經獲得國家發明專利，專利號為00119857.2。但是，生物農藥促生拮抗菌M18是一種活菌菌劑，其作用機理主要是通過M18活菌合成抗植物病害的活性成分實現對農作物植物病源菌的抑制作用，其合成的活性成分含量容易受到菌體本身的代謝調控機制和環境條件的影響。因而，對植物病害的防治效果具有不穩定性的缺陷，難以在農業生產中進行大規模的推廣應用。

已經查明，屬于假單胞菌的促生拮抗菌M18菌株，其防治植物病害的主要活性成分為之一為吩嗪-1-羧酸，從促生拮抗菌M18的發酵液中提取吩嗪-1-羧酸，利用活性成分而不是活菌對農作物病害的防治同樣具有高效、安全、廣譜、與環境相容性好等特征；同時，能克服利用促生拮抗菌M18防治病害效果不穩定的缺陷。但是，利用促生拮抗菌M18發酵合成吩嗪-1-羧酸的效價很低，僅為每升200毫克左右，如何提高發酵效價，降低使用成本，成為開發本產品的瓶頸所在。近年來，發明人運用基因工程手段，對促生拮抗菌M18基因組中的雙組分調控基因gacA開展了定向失活突變，獲得了M18衍生菌株M18G，大大提高了吩嗪-1-羧酸的產量，使其發酵效價達到每升1500-1700毫克左右。該研究成果的技術方法已經于2004年在《微生物學報》44卷第761～765頁公開，論文題目為《假單胞菌gacA插入突變對藤黃綠菌素和吩嗪-1-羧酸合成代謝的差異性調控》。發明人利用M18衍生菌株M18G攜帶重組質粒pME6032Phz，構建的基因工程菌株M18G/pME6032Phz，發明高效生產吩嗪-1-羧酸的方法，大大提高了吩嗪-1-羧酸的發酵效價，使吩嗪-1-羧酸的產量達到每升5700～6600毫克的水平，獲得了國家發明專利(申請號為CN200910198664.2)。但是，利用該技術生產吩嗪-1-羧酸需要異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的誘導，價格很高，提高了成本，不適宜大規模生產，同時，由于攜帶的重組質粒易于在發酵過程中丟失，會引起生產的不穩定性。

因而，目前的用于生產吩嗪-1-羧酸的生物工程菌株仍有待改進。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術中存在的缺陷，提供一種改進的用于生產微生物源殺菌劑吩嗪-1-羧酸的高效生物工程菌株及其應用技術。

因而，根據本發明的一個方面，本發明提供了一種生物工程菌株，所述生物工程菌株衍生自假單胞菌株M18G。根據本發明的實施例，相對于所述假單胞菌株M18G，所述生物工程菌株的基因組缺失吩嗪-1-羧酸合成基因簇上游5’-非編碼區。

需要說明的是，本發明所述的生物工程菌株，即一種改進的用于生產微生物源殺菌劑吩嗪-1-羧酸的高效生物工程菌株M18GU，其是通過運用無縫拼接技術制備的。其中，本發明所采用的表達方式“無縫拼接技術”是指一種DNA片段缺失技術。通常缺失DNA片段的技術，都需要在缺失處插入一個編碼抗生素抗性的標記基因作為篩選指標，表明該DNA區域已經缺失，以區別野生型的未缺失DNA片段的菌株，本發明構建的生物工程菌株M18GU，是通過缺失基因組中吩嗪-1-羧酸合成基因簇上游5’-非編碼區實現的。從理論上講，在非編碼區插入了諸如標記基因的其他序列后，將對基因表達產生難以預測的影響，因而，不允許插入諸如標記基因的其他序列。本發明采用的DNA片段缺失技術為一種無縫拼接法，即通過DNA序列之間的兩次同源重組，所引起的抗藥性改變和蔗糖致死性的改變篩選出突變菌株，在DNA片段缺失處不需要攜帶通常的選擇標記，直接將缺失區兩端的DNA連接，定向缺失M18衍生菌株M18G的基因組中吩嗪-1-羧酸合成基因簇(phz1)上游的5’-非編碼區，構建成基因突變菌株(M18GU)。由此，去除對吩嗪-1-羧酸合成基因簇phz1表達的抑制作用，從而，M18GU菌株合成吩嗪-1-羧酸的效率大大提高。