[發(fā)明專利]大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體的序列及用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410333080.2
• 申請(qǐng)日: 2013-02-28
• 公開（公告）號(hào): CN104073494A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳伶利;葛金文;李杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/115
• 分類號(hào): C12N15/115;G01N33/68;A61K48/00;A61P31/04
• 代理公司: 北京弘權(quán)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11363
• 代理人: 逯長(zhǎng)明;許偉群

本發(fā)明是于2013年2月28日申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)枮?01310062950.2、發(fā)明名稱為“大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體的序列及用途”的分案申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體的序列及用途。

背景技術(shù)

大腸桿菌(Escherichia?coli)是埃希氏菌屬的代表菌，是構(gòu)成人類腸道中的正常菌群之一，又是重要的條件致病菌，極易通過(guò)多種形式和途徑侵入腸道外的組織和器官，造成各種嚴(yán)重感染。隨著抗菌藥物的臨床廣泛應(yīng)用，誘導(dǎo)了大量該菌屬耐藥菌株的產(chǎn)生，并形成了該菌對(duì)單一抗菌藥物耐藥到對(duì)多種抗菌藥物同時(shí)耐藥，由低耐藥率到高耐藥率的發(fā)展，給臨床治療帶來(lái)了極大的困難，導(dǎo)致較高的病死率。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)大腸桿菌的耐藥性機(jī)理展開了深入的研究。研究表明，主動(dòng)外排泵為大腸桿菌多重耐藥的重要機(jī)制。大腸桿菌外排泵包括：RND、MFS、ABC、SMR、MATE五類，其中前三者必須與外膜蛋白(OMP)TolC構(gòu)成轉(zhuǎn)運(yùn)共同體，才能完成對(duì)多種藥物的外排，由此可見(jiàn)TolC是構(gòu)成大腸桿菌外排泵的重要組成成分。TolC是位于外膜上的孔道蛋白，上端為開放結(jié)構(gòu)，以便給外排底物提供泵出的寬闊通道；下端為封閉結(jié)構(gòu)。外排泵三聯(lián)復(fù)合物構(gòu)象的改變，可使孔道定期開放或閉合。TolC結(jié)構(gòu)的改變會(huì)引起它們?nèi)呦嗷プ饔玫臏p弱甚至三聯(lián)復(fù)合物的解體。在關(guān)于大腸桿菌外膜蛋白的研究報(bào)導(dǎo)中，很多結(jié)果提示了TolC蛋白在大腸桿菌的多重耐藥機(jī)制中起到至關(guān)重要的作用。但目前沒(méi)有報(bào)道通過(guò)改變?cè)摰鞍捉Y(jié)構(gòu)來(lái)抑制耐藥性。

適配體(Aptamers)的研究是一個(gè)新的熱點(diǎn)領(lǐng)域，它是能夠與許多目標(biāo)分子(蛋白，藥物，無(wú)機(jī)或有機(jī)分子)發(fā)生高親合性和特異性結(jié)合的一類單鏈核酸(DNA?or?RNA)。至今發(fā)現(xiàn)高親和特異性適配體的方法是配體指數(shù)富集系統(tǒng)展開(systematic?evolution?of?ligands?by?exponential?enrichment，SELEX)。由于適配體與配體分子結(jié)合的高特異性以及高親和性，在醫(yī)學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)和藥物研究等方面。Yuan等(Yuan?L，et?al，Anal?Chem，2007，79(3)：1082)利用等離子體表面共振成像與適配子技術(shù)建立蛋白質(zhì)芯片，檢測(cè)該蛋白質(zhì)芯片上吸附的蛋白抗體凝血酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)復(fù)合物。Cao等(Cao?X，et?al，Nucleic?Acids?Res，2009，37(14)：4621-8)利用篩選出的針對(duì)金黃色葡萄球菌的適配子來(lái)檢測(cè)金黃色葡萄球菌。

目前國(guó)內(nèi)外大部分從事核酸適配體研究的科學(xué)家和生物技術(shù)公司主要將適配體運(yùn)用于病毒感染、癌癥、自身免疫病、血管性疾病的臨床治療，并成為較為理想的臨床治療的新手段。其治療機(jī)制主要是通過(guò)折疊成一定的三維結(jié)構(gòu)直接與病理學(xué)相關(guān)蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，抑制這些蛋白質(zhì)的活性，以達(dá)到治療目的。Feng?H等(Feng?H，et?al，PLoS?One，2011，6(11)：e27862)篩選出了能與乙型肝炎病毒高親和力結(jié)合，干擾病毒P-ε復(fù)合物形成的適配體。但迄今尚無(wú)針對(duì)細(xì)菌外膜蛋白的適配體報(bào)道或公開，因此實(shí)有必要開發(fā)一種可特異性結(jié)合大腸桿菌外膜蛋白TolC的核酸適配體。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明擬考慮將核酸適配體應(yīng)用于改變TolC蛋白結(jié)構(gòu)來(lái)有效阻塞大腸桿菌外排泵外排活性。開發(fā)可特異性結(jié)合大腸桿菌外膜蛋白TolC的核酸適配體，為抑制大腸桿菌多重耐藥提供有力支持，具有重要的臨床價(jià)值。

本發(fā)明的目的是提供一種可特異結(jié)合大腸桿菌外膜蛋白TolC的核酸適配體。該適配體具有如下序列：SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4、SEQ?ID?NO：5、SEQ?ID?NO：6、SEQ?ID?NO：7、SEQ?ID?NO：8、SEQ?ID?NO：9、SEQ?ID?NO：10、SEQ?ID?NO：11、SEQ?ID?NO：12、SEQ?ID?NO：13、SEQ?ID?NO：14、SEQ?ID?NO：15、SEQ?ID?NO：16、SEQ?ID?NO：17、SEQ?ID?NO：18、SEQ?ID?NO：19或SEQ?ID?NO：20。

具體的，所述SEQ?ID?NO：1為：5’-TGCGTGTTTACGTGTCGATGTCCGGGTACCCTCGG-3’；

所述SEQ?ID?NO：2為：5’-CTCTTAGCCATTTTGGTATGCGTATTGCTCTACAG-3’；