[發(fā)明專利]運(yùn)動發(fā)酵單胞菌CRISPR-Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410332921.8
• 申請日: 2014-07-14
• 公開（公告）號: CN104109687A
• 公開（公告）日: 2014-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚雪梅;曹慶華;張義正;王海燕;馮紅
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/66;C12R1/01
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及運(yùn)動發(fā)酵單胞菌CRISPR-Cas9表達(dá)質(zhì)粒pSUZM1a-Cas9、pSUZM2a-Cas9、pSUZM3a-Cas9、pUC-T7sgRNA的構(gòu)建以及CRISPR-Cas9系統(tǒng)在大腸桿菌和運(yùn)動發(fā)酵單胞菌中的應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

運(yùn)動發(fā)酵單胞菌具有乙醇產(chǎn)率高，吸收糖效率高；酸和乙醇耐受性強(qiáng)；發(fā)酵時無需控制加氧；耐高滲透壓；基因組小（約2Mbp），易于開展基因（組）工程（gene?or?genome?engineering）育種等諸多優(yōu)點(diǎn)。但是，目前運(yùn)動發(fā)酵單胞菌未能大規(guī)模地、廣泛應(yīng)用于乙醇發(fā)酵生產(chǎn)，主要限制因素為：其不能將纖維素、半纖維素和淀粉等復(fù)雜的碳水化合物多聚體轉(zhuǎn)化為乙醇；產(chǎn)生多種副產(chǎn)物，如山梨醇、3-羥基丁酮、甘油、乙醛及乙酸、胞外果聚糖等。此外，運(yùn)動發(fā)酵單胞菌含有的天然質(zhì)粒較多，如Z.mobilis?ZM4中就有5個天然質(zhì)粒，總長度約為138kb，占該菌染色體長度的6.7%。大量天然質(zhì)粒的存在，使細(xì)菌在生長時浪費(fèi)了大量的能量和脫氧核苷酸用于質(zhì)粒的復(fù)制，而質(zhì)粒上存在的多個基因及其編碼的蛋白質(zhì)參與了一些生化反應(yīng)，其產(chǎn)物可能又會污染環(huán)境。

?CRISPR（Clustered?regularly?interspaced?short?palindromic?repeats）稱為“成簇規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列”（簡稱為CRISPR），是Janse等人于2002年在詳細(xì)比較和分析各種原核生物基因組后發(fā)現(xiàn)了這種重復(fù)序列，同時還發(fā)現(xiàn)在此重復(fù)序列的旁側(cè)經(jīng)常伴隨出現(xiàn)保守的基因。根據(jù)重復(fù)序列的排列特征，他們將這種獨(dú)特的重復(fù)序列命名為CRISPR，保守基因編碼的蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為CRISPR附屬蛋白（Cas，CRISPR-association?proteins）。研究發(fā)現(xiàn)在CRISPR位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物crRNA?(CRISPR?RNA)較基因序列短，是經(jīng)過核酸酶修飾加工后產(chǎn)生的，而Cas蛋白往往包含核酸結(jié)合、切割、修飾的功能域，所以人們推斷CRISPR-Cas系統(tǒng)可能與DNA復(fù)制、修復(fù)等DNA代謝有關(guān)。

CRISPR-Cas9編輯技術(shù)主要由兩個部分組成：靶序列sgRNA（single-guide?RNA）和Cas9蛋白質(zhì)。sgRNA分子是由兩段序列構(gòu)成：1）靶序列長度為20nt，它必須位于PAM序列之前，需要自行設(shè)計(jì)；2）crRNA-tracrRNA，該序列實(shí)際上是把CRISPR基因中的同向重復(fù)序列（directed?repeat）和tracrRNA用4個堿基GAAA連接在一起，以便形成可以為Cas9蛋白質(zhì)識別的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。sgRNA分子可以通過體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄而成，Cas9基因則是用相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。

當(dāng)把sgRNA和Cas9基因表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞后，sgRNA通過靶序列與基因?qū)?yīng)的互補(bǔ)序列配對，sgRNA中的其他序列則形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)能為Cas9所識別，然后在PAM（Protospacer-Adjacent?Motif）序列上游2-3堿基間將靶基因的DNA雙鏈切斷。斷裂的雙鏈DNA可以經(jīng)過兩種修復(fù)機(jī)制產(chǎn)生Indel突變或基因編輯：在非同源末端連接NHEJ（Non-homologous?End?Joining）修復(fù)機(jī)制下，斷裂的雙鏈DNA經(jīng)過DNA修復(fù)和重新連接，從而產(chǎn)生隨機(jī)的Indel突變。若突變發(fā)生在編碼區(qū)內(nèi)，會導(dǎo)致碼組移動（frameshift），造成編碼區(qū)提前出現(xiàn)終止密碼子。如果在轉(zhuǎn)化時同時導(dǎo)入新的DNA模板（質(zhì)粒DNA，雙鏈DNA，單鏈寡聚核苷酸single?strand?oligonucleotide,?ssODN），斷裂的雙鏈DNA就可以通過HDR（homology-directed?repair）途徑進(jìn)行準(zhǔn)確的基因組重組。綜上所述，細(xì)菌中內(nèi)源性質(zhì)粒的消除也可采用CRISPR-Cas9編輯技術(shù)。常規(guī)的質(zhì)粒消除方法有物理、化學(xué)等方法，這些方法的效率并不高，而且實(shí)驗(yàn)過程比較復(fù)雜。CRISPR-Cas技術(shù)可以用于任何細(xì)菌內(nèi)源質(zhì)粒的消除，具有極高的應(yīng)用價值；敲除了天然質(zhì)粒的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌，可以更好地用于燃料乙醇發(fā)酵的研究和生產(chǎn)；此方法可以應(yīng)用于運(yùn)動發(fā)酵單胞菌染色體基因的敲出和敲入，建立各種基因工程菌。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供運(yùn)動發(fā)酵單胞菌中CRISPR-Cas9系統(tǒng)表達(dá)質(zhì)粒pSUZM1a-Cas9、pSUZM2a-Cas9、?pSUZM3a-Cas9和pUC-T7sgRNA的構(gòu)建。