[發明專利]含人類骨保護素基因的重組慢病毒載體及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201410331750.7
• 申請日: 2014-07-11
• 公開（公告）號: CN104651386A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發明（設計）人: 蘇方;劉洪臣
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院;中國人民解放軍第306醫院
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/867;C12N7/01;C12N5/10;A61L27/38;A61L27/12;A61L27/54
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地，涉及一種制備重組慢病毒載體的方法。更具體地，涉及含有人類骨保護素基因的重組慢病毒及其制備方法以及該重組慢病毒載體在制備治療牙周骨缺損材料中的用途。

背景技術

牙周病是發生在牙齒支持組織的炎癥性、破壞性疾病，以牙槽骨的吸收破壞為主要特征。在臨床治療中通過牙周病的基礎治療、牙周手術(根面處理技術、引導性牙周組織再生術、骨移植)和藥物治療，對消除致病因素、促使炎癥減輕有一定療效，但難以恢復正常的牙槽嵴高度、形成新附著。

組織工程技術為牙周組織再生提供了新方法。生長因子是組織工程的重要因素，它們能調控包括牙周來源在內的多種細胞的增殖、遷移、分化和外基質的合成，在牙周組織再生的修復中發揮重要作用。但是傳統的組織工程方法應用生長因子時，多將生長因子局部注射或復合細胞和支架材料后植入體內，由于生長因子多為蛋白質或多肽，在體內極易降解，生物半衰期短，容易被體液沖走或稀釋，因此難以保持局部有效治療濃度。

基因治療為生長因子持續、穩定表達提供了新方法。借助基因治療的手段(如轉基因技術)，將生長因子的基因轉移到牙周組織相關靶細胞內，當基因導入靶細胞后，這些細胞便可以充當微型“生物工廠”，持續釋放細胞因子，促使靶細胞的表型向再生方向分化；并通過自分泌或旁分泌作用對細胞自身以及周圍未轉染的細胞產生作用，促使整個缺損區的所有細胞活化，從而提高牙周組織再生的成功率。

目前利用組織工程和基因治療技術以及兩者相結合促進牙周組織修復再生?已成為牙周領域的研究熱點。有部分學者利用該技術在牙周病治療、促進牙槽骨新生方面進行了研究，通過牙周膜細胞(Periodontal?ligament?cell_s，PDLC_s)體外培養，并將骨形成蛋白(Bone?morphogenetic?protein，BMPs)或血小板生長因子(Platelet-derived?growth?factor，PDGF)等促進骨形成基因轉染至牙周膜細胞，回植到牙周組織缺損處，發現有促進牙槽骨形成的作用。然而，牙周組織是由牙骨質、牙周膜、牙槽骨與牙齦共同構成的三維結構，牙周病是細菌等各種病原因素對這四者的共同破壞，雖然通過牙周手術，包括使用牙周組織工程方法在提供修復用細胞、促進組織形成等方面有一定作用，但是，在病變牙周組織中主要是各種刺激因素導致的大量破骨細胞活化，抑制了牙周組織的成骨能力，使組織修復無法達到理想效果。因此，單一依靠促進骨形成來治療牙周病效果未盡人意。

骨保護素(osteoprotegerin，OPG)是近年來發現的一種能阻止破骨細胞分化、成熟，抑制骨吸收的關鍵因子。骨保護素是核因子κB受體活化因子配體(receptor?activator?of?nuclear?factorκB?ligand，RANKL)的天然誘餌受體，能競爭性地與核因子κB受體活化因子配體結合，阻斷核因子κB受體活化因子(Receptor?activator?of?nuclear?factor-κB，RANK)與核因子κB受體活化因子配體間的相互作用，從而抑制破骨細胞的形成和活化，抑制骨吸收。研究發現，核因子κB受體活化因子配體水平升高可以導致牙周組織的破壞；檢測牙周病患者齦溝液顯示，RANKL/OPG比率比健康人群明顯升高；細菌產生的毒素或是組織表達的炎癥介質也是通過影響RANKL/OPG比率而影響組織修復的。這些研究結果表明，OPG/RANKL/RANK系統在牙周骨代謝中是重要的分子調節機制之一。

牙周組織中最重要的一種細胞是PDLC_s，有學者研究發現PDLC_s可以表達骨保護素和核因子κB受體活化因子配體，在沒有受到外界刺激時骨保護素表達較核因子κB受體活化因子配體強，不利于破骨生成，以維持牙周內環境的穩定。揭示了PDLC_s是通過OPG/RANKL系統來調節牙槽骨代謝的。由于PDLC_s位于牙槽骨和牙骨質之間，其分泌的骨保護素可能在抵御炎癥組織中核因子κB受體活化因子配體介導的骨吸收中發揮一定的防御功能。

近年來，國內外學者利用骨保護素防治因破骨細胞過度活化而引起的骨吸收疾病做了大量研究，發現骨保護素可有效抑制骨質疏松性骨吸收、惡性腫瘤骨轉?移破壞等骨質吸收疾病。但使用骨保護素治療牙周骨缺損還未見報道。

發明內容

本發明是基于發明人的下列發現而完成的：