[發明專利]植物病毒表達載體及其用于在植物基因組中產生遺傳型變異的用途在審

申請號：	201410331456.6	申請日：	2009-04-21
公開（公告）號：	CN104263751A	公開（公告）日：	2015-01-07
發明（設計）人：	A.瓦因斯坦;A.朱克	申請（專利權）人：	丹齊格創新有限公司;耶路撒冷希伯來大學伊森姆研究發展公司
主分類號：	C12N15/83	分類號：	C12N15/83;A01H5/00
代理公司：	中國專利代理(香港)有限公司 72001	代理人：	羅文鋒;權陸軍
地址：	以色列***	國省代碼：	以色列;IL
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摘要：
搜索關鍵詞：	植物病毒表達載體及其用于基因組產生遺傳型變異用途
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【權利要求書】：

1.?植物病毒表達載體，其包含pTRV骨架和編碼異源多肽的核酸序列，所述核酸序列缺乏如SEQ?ID?NO:?43所示的2b序列。

2.?權利要求1的植物病毒表達載體，其中所述異源多肽包含兆堿基大范圍核酸酶。

3.?權利要求1的植物病毒表達載體，其中所述異源多肽包含嵌合核酸酶。

4.?權利要求2的植物病毒表達載體，其中所述嵌合核酸酶包含DNA結合結構域和核酸酶。

5.?權利要求4的植物病毒表達載體，其中所述核酸酶選自限制性酶、拓撲異構酶、重組酶、整合酶和DNA酶。

6.?權利要求4的植物病毒表達載體，其中所述核酸酶包含II型限制性內切核酸酶的切割結構域。

7.?權利要求4的植物病毒表達載體，其中所述核酸酶選自FokI、I-SceI、I-CeuI、歸巢核酸酶、DNA促旋酶、真核拓撲異構酶II、細菌拓撲異構酶IV、拓撲異構酶VI、Cre重組酶、Hin重組酶、Rad51/?RecA、脫氧核糖核酸酶I、脫氧核糖核酸酶II和微球菌核酸酶。

8.?權利要求4的植物病毒表達載體，其中所述DNA結合結構域選自螺旋-轉角-螺旋(pfam?01381)、亮氨酸拉鏈(ZIP)結構域、翼狀螺旋(WH)結構域、翼狀螺旋轉角螺旋結構域(wHTH)、螺旋-環-螺旋和鋅指結構域。

9.?權利要求4的植物病毒表達載體，其中所述嵌合核酸酶進一步包含定位至含DNA細胞器的定位信號。

10.?權利要求2的植物病毒表達載體，其中所述兆堿基大范圍核酸酶進一步包含定位至含DNA細胞器的定位信號。

11.?權利要求1的植物病毒表達載體，其中所述核酸序列編碼兩種異源多肽。

12.?權利要求1的植物病毒表達載體，其中所述pTRV為pTRV2。

13.?權利要求11的植物病毒表達載體，其中所述核酸序列包含兩個分離的亞基因組啟動子(sgP)，用于調節所述兩種異源多肽的轉錄。

14.?權利要求11的植物病毒表達載體，其中所述兩種異源多肽由編碼切割結構域的核酸序列分離開。

15.?權利要求14的植物病毒表達載體，其中所述切割結構域包含如SEQ?ID?NO:?40所示的T2A-樣蛋白序列。

16.?產生植物的方法，所述方法包括將至少一種權利要求1-15中任一項的植物病毒表達載體引入所述植物的一個或多個細胞中。

17.?在植物基因組中產生遺傳型變異的方法，所述方法包括將至少一種權利要求4-9中任一項的植物病毒表達載體引入所述植物中，其中所述的DNA結合結構域介導所述核酸酶特異性地靶向植物基因組，由此在植物基因組中產生遺傳型變異。

18.?權利要求17的方法，其進一步包括將DNA載體引入所述植物中。

19.?治療病原體的植物感染的方法，所述方法包括將至少一種權利要求4-9中任一項的植物病毒表達載體引入所述植物中，其中所述的DNA結合結構域介導所述核酸酶特異性地靶向病原體基因組，由此預防或治療病原體的植物感染。

20.?標記植物基因組的方法，所述方法包括將至少一種權利要求4-9中任一項的植物病毒表達載體引入所述植物中，其中所述的DNA結合結構域介導所述核酸酶特異性地靶向植物基因組，由此標記植物基因組。

21.?在植物中產生雄性不育的方法，所述方法包括在所述植物中上調與雄性不育相關的線粒體或葉綠體結構或功能基因，其通過將至少一種權利要求9的植物病毒表達載體和包含至少一種當靶向至所述線粒體或葉綠體基因組時能上調線粒體或葉綠體所述結構或功能基因的異源核酸序列的核酸表達構建物引入植物中，其中所述定位至含DNA細胞器的定位信號包含線粒體或葉綠體定位信號，由此在植物中產生雄性不育。

22.?產生除草劑抗性植物的方法，所述方法包括將至少一種權利要求4-9中任一項的植物病毒表達載體引入所述植物中，其中所述的DNA結合結構域介導所述核酸酶靶向賦予對除草劑敏感性的基因，由此產生除草劑抗性植物。

23.?權利要求16-22中任一項的方法，其中所述的植物選自矮牽牛(Petunia?hybrida)、擬南芥(Arabidopsis?thaliana)、青蒿(Artemisia?annua)、甜菜(Beta?vulgaris)、馬鈴薯(Solanum?tuberosum)、Solanum?pimpinellifolium、番茄(Solanum?lycopersicum)、茄子(Solanum?melongena)、菠菜(Spinacia?oleracea)、豌豆(Pisum?sativum)、甜椒(Capsicum?annuum)、黃瓜(Cucumis?sativus)、本氏煙(Nicotiana?benthamiana)、煙草(Nicotiana?tabacum)、玉米(Zea?mays)、甘藍型油菜(Brassica?napus)、陸地棉(Gossypium?hirsutum)?cv.?Siv’on、稻(Oryza?sativa)和?Oryza?glaberrima。