[發明專利]一種通用型鴨甲型肝炎病毒抗體ELISA檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201410328785.5
• 申請日: 2014-07-10
• 公開（公告）號: CN104087609A
• 公開（公告）日: 2014-10-08
• 發明（設計）人: 馬秀麗;黃兵;李玉峰;于可響;劉存霞;宋敏訓;劉玉山;史玉穎
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院家禽研究所
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C07K19/00;G01N33/68;G01N33/543
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 韓百翠

1.一種鴨甲型肝炎病毒DHAV-1VP3-3VP1重組蛋白，其特征是，由下述方法制備獲得：

1)以DHAV-1病毒作為材料，通過RT-PCR方法對其VP3基因進行擴增、克隆得到重組質粒pMD-1VP3；

2)以DHAV-3病毒作為材料，通過RT-PCR方法對其VP1基因進行擴增、克隆得到重組質粒pMD-3VP1；

3)以BamH?I和Sal?I同時對重組質粒pMD-1VP3和pET-32a(+)載體進行酶切，回收目的片段，16℃連接過夜，轉化DH5α感受態細胞，提取質粒，經BamH?I和Sal?I雙酶切鑒定正確后獲得陽性重組質粒pET-1VP3；以Sal?I和Xhol?I同時對重組質粒pMD-3VP1和pET-1VP3進行酶切，回收目的片段，16℃連接過夜，轉化BL21(DE3)感受態細胞，提取質粒，經Sal?I和Xhol?I雙酶切鑒定正確后獲得陽性重組表達質粒pET-1VP3-3VP1；

4)將獲得的陽性質粒菌于37℃培養，待A600值達到0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度為0.8mmol/L進行誘導表達，收集誘導表達后5h的菌體，超聲波破碎，離心后取沉淀進一步分離純化。

2.如權利要求1所述的鴨甲型肝炎病毒DHAV-1VP3-3VP1重組蛋白，其特征是，所述擴增VP3基因的上下游引物分別是：

上游引物：5'-AAGGGATCCGGAAAGAGAAARCCACG-3'，

下游引物：5'-ATCGTCGACCTGATYATTGGTTGCCAT-3'；

擴增片段大小為711bp。

3.如權利要求1所述的鴨甲型肝炎病毒DHAV-1VP3-3VP1重組蛋白，其特征是，所述擴增VP1基因的上下游引物分別是：

上游引物：5'-ATTGTCGACGGTGATTCCAATCAGCTTG-3'，

下游引物：5'-AGTCTCGAGTTCAATYTCCARATGGAG-3'；

擴增片段大小為720bp。

4.一種通用型鴨甲型肝炎病毒抗體ELISA檢測試劑盒，其特征是，包括以權利要求1-3中任意一項所述的DHAV-1VP3-3VP1重組蛋白包被的ELISA板。

5.如權利要求4所述的通用型鴨甲型肝炎病毒抗體ELISA檢測試劑盒，其特征是，所述ELISA板的制備方法為：用pH8.5的0.05M?Tris-HCL緩沖液作包被液，將DHAV-1VP3-3VP1重組蛋白稀釋為10μg/mL，按100μL/孔加入ELISA反應板中，37℃作用2小時，4℃包被過夜，拍干，用1％牛血清白蛋白37℃封閉2小時，以含0.05％吐溫-20pH7.4的PBS洗滌，拍干，再加入20％蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護3小時。

6.如權利要求4或5所述的通用型鴨甲型肝炎病毒抗體ELISA檢測試劑盒，其特征是，還包括樣品稀釋液、10×濃縮洗滌液、酶結合物工作液、顯色液、終止液、陽性對照和陰性對照。

7.如權利要求6所述的通用型鴨甲型肝炎病毒抗體ELISA檢測試劑盒，其特征是，所述樣品稀釋液為含0.05％吐溫-20的0.01M?pH7.4的磷酸鹽緩沖液；所述10×濃縮洗液為含0.5％吐溫-20的0.1M?pH7.4的磷酸鹽緩沖液；所述酶結合物工作液為HRP-羊抗鴨IgG；所述顯色液為0.2mg/mL四甲基聯苯胺溶液和含0.5‰過氧化氫尿素的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液，二者體積比為1：1；所述終止液為0.31％氫氟酸溶液；所述陽性對照為經DHAV-1VP3-3VP1重組蛋白免疫獲得的陽性血清，其OD_650nm≥1.0，加入1000U/mL的青鏈霉素，無菌過濾；所述陰性對照為經篩選獲得的陰性血清，其OD_650nm≤0.25，加入1000U/mL的青鏈霉素，無菌過濾。

8.如權利要求7所述的通用型鴨甲型肝炎病毒抗體ELISA檢測試劑盒，其特征是，包括以下組分：以DHAV-1VP3-3VP1重組蛋白包被的ELISA板：5塊；樣品稀釋液：200mL；10×濃縮洗滌液：400mL；酶結合物工作液：50mL；顯色液：100mL；終止液：60mL；陽性對照：2mL；陰性對照：2mL。