[發明專利]一種流感血凝素糖蛋白多聚物納米顆粒的制備方法

有效

• 申請號: 201410328217.5
• 申請日: 2014-07-10
• 公開（公告）號: CN105233302B
• 公開（公告）日: 2018-10-19
• 發明（設計）人: 吳軍;劉波;唱韶紅;鞏新;王莎
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/145;A61K9/14;A61P31/16
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;陳曉慶

1.一種制備流感病毒血凝素糖蛋白聚合物納米顆粒的方法，包括如下步驟：使N端上游含有信號肽序列、并包含C-端穿膜區序列的流感病毒的血凝素HA基因在酵母中表達；將所述酵母進行細胞破碎，加入去污劑，獲得含流感病毒血凝素糖蛋白的溶液；將所述溶液進行純化，制備得到具有血凝活性的流感病毒血凝素糖蛋白聚合物納米顆粒。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述使N端上游含有信號肽序列、并包含C-端穿膜區序列的流感病毒的血凝素HA基因在酵母中表達的方法為將N端上游含有信號肽序列、并包含C-端穿膜區序列的流感病毒的血凝素HA基因的重組表達載體轉化酵母，培養得到轉化的酵母，再誘導使基因表達；

所述酵母為畢赤酵母、漢遜酵母或乳酸克魯維酵母。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述流感病毒的血凝素HA為H1、H3、H5或H7血清型流感病毒的HA。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述H1、H3、H5或H7血清型流感病毒的HA分別為H1N1、H3N2、H5N1或H7N9流感病毒的HA。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述重組表達載體是將所述N端上游含有信號肽序列、并包含C-端穿膜區序列的流感病毒的血凝素HA基因插入含有AOX啟動子的載體得到，具體是將所述N端上游含有信號肽序列、并包含C-端穿膜區序列的流感病毒的血凝素HA基因插入pPICZα的NotI和NspV酶切位點間，并用BglII線性化得到；

所述酵母為畢赤酵母；

所述流感病毒為H7N9禽流感病毒，所述N端上游含有信號肽序列、并包含C-端穿膜區序列的流感病毒的血凝素HA基因如SEQ ID No.4所示；

或，

所述流感病毒為甲型H1N1流感病毒，所述N端上游含有信號肽序列、并包含C-端穿膜區序列的流感病毒的血凝素HA基因如SEQ ID No.14所示；

或，

所述流感病毒為甲型H3N2流感病毒，所述N端上游含有信號肽序列、并包含C-端穿膜區序列的流感病毒的血凝素HA基因如SEQ ID No.21所示。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述重組表達載體是將所述N端上游含有信號肽序列、并包含C-端穿膜區序列的流感病毒的血凝素HA基因插入含有MOX啟動子的載體得到，具體是將所述N端上游含有信號肽序列、并包含C-端穿膜區序列的流感病毒的血凝素HA基因插入pPICZα的NotI和BstB I酶切位點間，得到中間載體1；再將中間載體1的AOX啟動子替換為漢遜酵母的醇氧化酶啟動子MOX，再用BglII線性化得到；

所述酵母為漢遜酵母；所述漢遜酵母為多型漢遜酵母；

所述MOX啟動子是以多型漢遜酵母的基因組DNA為模板，以SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10所示的DNA分子為引物進行PCR擴增得到MOX啟動子；

所述將中間載體1的AOX啟動子替換為漢遜酵母的醇氧化酶啟動子MOX的方法為將所述PCR擴增得到的MOX啟動子進行BglII酶切，并進行磷酸化，獲得5’端為BglII酶切粘性末端，3’端磷酸化的MOX啟動子；將中間載體1用NspV單酶切后用Klenow fragment大片段酶和dNTP補平，得到片段，回收片段后，再用BglII酶切，切除AOX啟動子，得到切除AOX啟動子的中間載體1；將5’端為BglII酶切粘性末端，3’端磷酸化的MOX啟動子與切除AOX啟動子的中間載體1連接；

所述流感病毒為H5N1禽流感病毒，所述N端上游含有信號肽序列、并包含C-端穿膜區序列的流感病毒的血凝素HA基因具體如SEQ ID No.8所示。