[發明專利]用于檢測25-羥基維生素D的檢測劑及制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410328010.8
• 申請日: 2014-07-10
• 公開（公告）號: CN104076155A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發明（設計）人: 饒微;李婷華;杜凱;袁錦云;羅凱;余慧玲
• 申請（專利權）人: 深圳市新產業生物醫學工程股份有限公司
• 主分類號: G01N33/82
• 分類號: G01N33/82;G01N33/532
• 代理公司: 北京聿宏知識產權代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;劉烽

1.一種用于檢測25-羥基維生素D的檢測劑，其包括25-羥基維生素D抗原衍生物與蛋白載體形成的偶聯物，以及被所述偶聯物包被的磁球。

2.根據權利要求1所述的檢測劑，其特征在于，所述25-羥基維生素D抗原衍生物的結構式為：

其中，m為0、1、2或3，n為2、3、4、5或6。

3.根據權利要求1或2所述的檢測劑，其特征在于，所述蛋白載體選自牛血清白蛋白、陽離子牛血清白蛋白、血藍蛋白、卵清蛋白、血清白蛋白、牛γ球蛋白和人γ球蛋白中的任一種或多種。

4.根據權利要求1或2所述的檢測劑，其特征在于，所述磁球表面帶有環氧基、磺酰基、羧基、氨基、醛基、酰胺基、巰基和羥基中的一種或多種基團。

5.根據權利要求1或2所述的檢測劑，其特征在于，所述磁球的粒徑大小為0.8-3.0μm。

6.一種如權利要求1-5中任一項所述的用于檢測25-羥基維生素D的檢測劑的制備方法，包括使用所述25-羥基維生素D抗原衍生物和蛋白載體形成的偶聯物包被磁球。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在包被磁球之前，使用第一活化劑將磁球進行活化處理，并將經所述活化處理后的磁球分散于緩沖液中，并加入25-羥基維生素D抗原衍生物與蛋白載體形成的偶聯物進行反應，經固液分離，清洗固體，得到所述檢測劑；

其中，所述第一活化劑為N，N-二環己基碳二亞胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽中的至少一種或其與N-羥基琥珀酰亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽中的至少一種的混合物。

8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法還包括25-羥基維生素D抗原衍生物與蛋白載體形成的偶聯物的制備步驟，所述制備步驟包括使所述25-羥基維生素D抗原衍生物和所述蛋白載體在偶聯劑和溶劑的存在下進行偶聯反應生成所述偶聯物；

其中，所述偶聯劑選自戊二醛、N,N'-二琥珀酰亞胺基碳酸酯中的至少一種；和/或所述溶劑選自二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、丙酮、氯仿中的至少一種。

9.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法還包括25-羥基維生素D抗原衍生物與蛋白載體形成的偶聯物的制備步驟，所述制備步驟包括：

m)使25-羥基維生素D抗原衍生物帶有羧基，并使用第二活化劑進行活化；

n)將活化后的25-羥基維生素D抗原衍生物與蛋白載體在溶劑的存在下進行偶聯，經分離得到所述偶聯物；

其中，所述第二活化劑為N-羥基琥珀酰亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽中的至少一種和N，N-二環己基碳二亞胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽中的至少一種的混合物；和/或所述溶劑選自二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、丙酮、氯仿中的至少一種。

10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述25-羥基維生素D抗原衍生物與蛋白載體的摩爾比為10-20:1。

11.一種用于檢測25-羥基維生素D的免疫學方法，包括使結合標記物的25-羥基維生素D抗體和如權利要求1-5中任一項所述的檢測劑與待測樣本中的25-羥基維生素D競爭結合。

12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于，所述標記物選自熒光標記物、發光標記物、生物素標記物、金標記物或酶標記物。

13.一種用于檢測25-羥基維生素D的發光免疫學方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

a)將待測樣本與發光標記物標記的25-羥基維生素D抗體進行溫育；

b)向步驟a)的混合物中加入如權利要求1-5中任一項所述的檢測劑，使所述發光標記物標記的25-羥基維生素D抗體與所述檢測劑和待測樣本中的25-羥基維生素D競爭結合；

c)磁分離，得到發光標記物標記的25-羥基維生素D抗體與所述檢測劑的結合物；

d)向步驟c)得到的結合物中加入激發底物，使其產生發光信號；

e)根據步驟d)測定的發光信號強度計算待測樣本中的25-羥基維生素D含量。