[發明專利]一種miRNA、miRNA的前體、以及它們的編碼基因和應用

有效

• 申請號: 201410327915.3
• 申請日: 2014-07-10
• 公開（公告）號: CN104164425B
• 公開（公告）日: 2017-05-17
• 發明（設計）人: 孫曉麗;朱延明;端木慧子;王孫婷;孫中文
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/15;C12N1/19;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種miRNA、miRNA的前體、以及它們的編碼基因和應用。

背景技術

低溫冷害嚴重影響植物生長發育及作物產量，已經成為農作物生產的重要限制因子。作為一種冷敏感型農作物，水稻從種子發芽到成熟的整個生長發育期間都極易受到冷害威脅，嚴重時致水稻減產30％-40％。因此，解決水稻冷害問題對于提高水稻產量、品質，促進水稻產區的經濟發展具有重大的戰略意義。隨著分子生物學的飛速發展和轉基因技術的日趨成熟，通過轉基因分子育種培育耐冷轉基因水稻已成為可能。

miRNA(microRNA，微小RNA)是一類在生物體中廣泛存在的長度約為20-24nt的內源單鏈非編碼小分子RNA。近年來大量研究表明，miRNA通過完全/不完全與靶mRNA3’UTR互補結合抑制靶mRNA的翻譯或直接介導靶mRNA的降解，進而調控植物生長發育以及逆境脅迫應答等眾多重要生物學過程。

發明內容

本發明的目的是提供一種miRNA、miRNA的前體、以及它們的編碼基因和應用。

本發明保護一種miRNA，如序列表的序列2所示。編碼所述miRNA的基因也屬于本發明的保護范圍。含有編碼所述miRNA的基因的DNA分子也屬于本發明的保護范圍。含有編碼所述miRNA的基因的表達盒、重組載體、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。

本發明還保護一種RNA(miRNA的前體)，如序列表的序列1所示。編碼所述RNA的基因也屬于本發明的保護范圍。含有編碼所述RNA的基因的表達盒、重組載體、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。

含有編碼所述miRNA的基因的DNA分子也屬于本發明的保護范圍。含有編碼所述miRNA的基因的DNA分子具體可如序列表的序列3自5’末端第9-387位核苷酸所示。含有序列表的序列3自5’末端第9-387位核苷酸所示的DNA分子的表達盒、重組載體、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。所述重組質粒具體可為在pCAMBIA330035Su載體中插入序列表的序列3自5’末端第9-387位核苷酸所示的雙鏈DNA分子得到的重組質粒pCAMBIA-pre-miR1868。

本發明還保護一種培育轉基因植物的方法，是將編碼所述miRNA的基因、編碼所述RNA的基因或序列表的序列3自5’末端第9-387位核苷酸所示的雙鏈DNA分子導入目的植物，得到耐冷性高于所述目的植物的轉基因植物。所述方法具體可為：將重組質粒pCAMBIA-pre-miR1868導入目的植物，得到耐冷性高于所述目的植物的轉基因植物。所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體可為水稻，如水稻品種“空育131”。

所述耐冷性高具體可體現為如下(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)和(Ⅳ)中的至少一種：

(Ⅰ)在低溫環境中，所述轉基因植物的存活率高于所述目的植物；

(Ⅱ)在低溫環境中，所述轉基因植物地上部分的游離脯氨酸含量高于所述目的植物；

(Ⅲ)在低溫環境中，所述轉基因植物葉片的可溶性糖含量高于所述目的植物；

(Ⅳ)在低溫環境中，所述轉基因植物葉片的電導率低于所述目的植物。

以上任一所述低溫環境具體可為4℃環境。

本發明還保護編碼所述miRNA的基因、編碼所述RNA的基因或序列表的序列3自5’末端第9-387位核苷酸所示的雙鏈DNA分子在培育耐冷植物中的應用。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體可為水稻，如水稻品種“空育131”。

本發明對于培育耐冷植物，從而增加植物產量具有重大價值。

附圖說明

圖1為miR1868的相對表達量。

圖2為重組質粒的構建流程示意圖。

圖3為PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖4為重組質粒pCAMBIA-pre-miR1868的部分元件示意圖。

圖5為再生植株PCR鑒定的部分結果。

圖6為PCR陽性植株Southern Blot鑒定的結果。

圖7為轉基因水稻株系中miR1868的相對表達量。

圖8為轉基因水稻的耐冷性分析的結果。

圖9為轉pre-miR1868水稻冷脅迫下生理指標的測定的結果。

具體實施方式