[發(fā)明專利]一種鑒別蛙病毒屬病毒的三重實(shí)時(shí)熒光PCR引物、探針和試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410327903.0
• 申請(qǐng)日: 2014-07-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104099428A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張利峰;李江宇;凌鳳俊;任彤;高志強(qiáng);谷強(qiáng);張偉;王樹(shù)云;劉艷華;王娜;景宏麗;張旻;賈佩嶠;江育林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心;中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院;北京海森通生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 趙曉丹

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種鑒別蛙病毒屬病毒的三重實(shí)時(shí)熒光PCR引物、探針和試劑盒，可同時(shí)篩查13種蛙病毒屬病毒，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。

背景技術(shù)

近年來(lái)，由虹彩病毒科蛙病毒屬引起的魚(yú)類、兩棲類和爬行類的疾病遍布全球，涉及許多組織系統(tǒng)性感染疾病，出現(xiàn)病癥后的宿主動(dòng)物死亡率高達(dá)100％，給水產(chǎn)業(yè)造成了非常大的經(jīng)濟(jì)損失。在亞洲、大洋洲、歐洲、北美洲和南美洲等地區(qū)從自然生存、養(yǎng)殖、健康以及死亡的蛙中均分離到了蛙病毒屬病毒，蛙病毒屬已被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定為必須申報(bào)的水生動(dòng)物疫病之一。

蛙病毒屬屬于虹彩病毒科，為裸露或有囊膜的二十面體病毒粒子，病毒直徑約150～170nm，基因組是單一線狀雙鏈DNA，全長(zhǎng)為150～170kb，GC含量為49％～55％，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都能復(fù)制。其結(jié)構(gòu)蛋白主衣殼蛋白(major?capsid?protein，MCP)占整個(gè)病毒粒子多肽的40～45％，具有高度的保守性，又具有足夠的變異性，氨基酸同源性達(dá)65.9％，是虹彩病毒進(jìn)化和分類的重要依據(jù)，所以本發(fā)明利用MCP的同源性差異進(jìn)行蛙病毒屬病毒的鑒別和區(qū)分，該方法是可靠的。

由于蛙病毒屬病毒的基因序列相似性達(dá)90％以上，所以設(shè)計(jì)特異的引物和探針對(duì)于區(qū)分和鑒別蛙病毒屬病毒非常關(guān)鍵。目前，研究者們建立了虹彩病毒蛙病毒屬實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測(cè)方法、虎紋蛙病毒(tiger?frog?virus，TFV)的普通PCR方法、大口黑鱸虹彩病毒(Largemouth?bass?virus，LMBV)的雙重PCR檢測(cè)方法以及大鯢虹彩病毒ADIV(Andrias?davidiamus?iridovirus)TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)方法，上述方法，對(duì)于同一個(gè)檢測(cè)樣本，最多能鑒別和區(qū)分2種蛙病毒屬病毒，而本發(fā)明第一次建立了蛙病毒屬病毒的三重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，對(duì)于同一個(gè)檢測(cè)樣本，可同時(shí)鑒別和區(qū)分13種蛙病毒屬病毒，降低了檢測(cè)成本，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了高通量處理樣本的簡(jiǎn)便性，該方法具有快速性、準(zhǔn)確性和高靈敏性的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異和高效的鑒別蛙病毒屬病毒的三重實(shí)時(shí)熒光PCR引物、探針和試劑盒。該方法檢測(cè)覆蓋蛙病毒屬病毒種類多，是一種特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高、靈敏性高的檢測(cè)方法。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一組鑒別蛙病毒屬病毒的三重實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針，其中，采用一對(duì)通用引物，正向引物為5′-ATGGTGCARAACGTCA-3′(SEQ?ID?NO：1)，反向引物為5′-GCTCCAKSACSGTGTT-3′(SEQ?ID?NO：2)。

所述探針如下所示：

探針1：5′-CTTCCGTCGGCTCCAATTACACC-3′(SEQ?ID?NO：3)

探針2：5′-CCAACAACAGGAGTGACGCAAGTG-3′(SEQ?ID?NO：4)

探針3：5′-CTGTGGGTTCAAATTATACGTGTGT-3′(SEQ?ID?NO：5)

其中，所述序列SEQ?ID?NO：3為鑒別沼澤綠牛蛙虹彩病毒RGV(Rana?grylio?virus)、中華鱉虹彩病毒STIV(Soft-shelled?Turtle?iridovirus)、虹彩病毒3型FV3(frog?virus3)、飾紋汀蟾(穴居蛙)虹彩病毒BIV(Limnodynastes?ornatus?or?bohel?iridovirus)、虎紋蛙病毒TFV(tiger?frog?virus)、大鯢虹彩病毒ADIV(Andrias?davidiamus?iridovirus)、流行性造血器官壞死癥病毒EHNV(Epizootie?hematopoietie?necrosis?virus)、歐洲鮰魚(yú)病毒ECV(European?catfish?iridovirus)和歐鯰病毒ESV(European?sheetfish?iridovirus)的探針，并且5′端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端標(biāo)記BHQ1淬滅基團(tuán)。

所述序列SEQ?ID?NO：4為鑒別大口黑鱸病毒LMBV(Largemouth?bass?virus)、裂唇魚(yú)病毒DFV(doctor?fish?virus)和孔雀魚(yú)病毒6型GV6(guppy?virus6)的探針，并且5′端標(biāo)記HEX熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端標(biāo)記BHQ1淬滅基團(tuán)；LMBV、DFV和GV6統(tǒng)稱為SCRV(Santee-Cooper?ranavirus)。