[發明專利]一種細胞分離微結構系統

在審

• 申請號: 201410326028.4
• 申請日: 2014-07-09
• 公開（公告）號: CN104073428A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發明（設計）人: 韓平疇;湯哲文;呂佩濤
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00
• 代理公司: 北京市邦道律師事務所 11437
• 代理人: 邸建凱

技術領域

本發明涉及生物及醫學體外檢測技術領域，尤其涉及一種能用于從生物流體中分離富集稀有細胞的微結構系統，該系統可用于人體血液中循環腫瘤細胞(Circulating?Tumor?Cell,CTC)和尿液中的尿脫落癌細胞(Urine?Exfoliated?Tumor?Cell,UETC)的分離富集、計數與回收。

背景技術

稀有細胞是指生物樣本中存在的數量稀少的確具有重要生物學功能的或臨床檢測意義的細胞。如人體外周血中的循環腫瘤細胞、循環內皮細胞、被病毒感染的細胞，實體腫瘤血管中的腫瘤干細胞，人體淋巴液中的脫落腫瘤細胞，人體尿液中的尿脫落腫瘤細胞等。

一、CTC分離富集及后續檢測技術。

人體血液中循環腫瘤細胞是一類具有代表性的稀有細胞。它是指因自發或診斷、手術、放化療操作等外部因素引起的由腫瘤病灶播散進入外周血循環的腫瘤細胞，并在一定條件下可以發展成為新的腫瘤轉移灶(Racila?E,Euhus?D,Weiss?AJ,et?al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998,95,4589-4594；Pantel?K,Brakenhoff?RH,Nat.Res.Cancer2004,4,448-456)。腫瘤轉移是癌癥患者致死的主要原因，調查顯示超過90％的癌癥患者死于腫瘤轉移(Mehlen?P,Puisieux?A,Nat.Rev.Cancer2003,3,453-458)。臨床研究表明，患者血液中CTC的濃度與腫瘤轉移情況及患者存活率密切相關(Massimo?Cristofanilli,M.D.,G.Thomas?Budd,M.D.,Matthew?J.Ellis,M.B.,Ph.D.,Alison?Stopeck,M.D.,Jeri?Matera,B.S.,R.Ph.,M.Craig?Miller,B.S.,James?M.Reuben,Ph.D.,Gerald?V.Doyle,D.D.S.,W.Jeffrey?Allard,Ph.D.,Leon?W.M.M.Terstappen,M.D.,Ph.D.,and?Daniel?F.Hayes,M.D.N?Engl?J?Med2004；351:781-791)。因此，循環腫瘤細胞是一種具有重大生物學意義和臨床價值的稀有細胞，從血液中分離富集和回收循環腫瘤細胞的醫學和后續研究意義越來越受到人們的重視。但是，循環腫瘤細胞在外周血中的含量極少，每10ML血液可能僅含有幾個到幾百個不等的循環腫瘤細胞，卻有高達約1億個白細胞和約5億個紅細胞(Zhe?XN,Cher?ML,Bonfil?RD,Am.J.Cancer?Res.2011,1,7409-751)。因此在大量其他細胞干擾下無法對循環腫瘤細胞進行直接檢測，這些檢測包括數量、基因突變、表面標志物、細胞活性、分泌蛋白譜、力學性質等，所以利用簡單有效的辦法將循環腫瘤細胞從外周血中分離出來對后續的檢測具有決定性的意義。

目前，血液樣品中CTC的檢測技術主要包括：免疫細胞化學技術、差減富集技術、細胞物理性質差異化分選技術。

1.免疫細胞化學技術(Immunocytochemistry,ICC)是指以顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗體抗原反應和細胞化學的呈色反應，對相應抗原進行定位、定性和定量測定的技術。目前ICC技術檢測的腫瘤標記物主要包括上皮細胞角蛋白(CK)、上皮細胞膜特異性抗體(如黏蛋白類)以及腫瘤相關糖蛋白(TAG)者3類。ICC技術可對CTC進行細胞表面和形態學分析，但許多分化差的腫瘤細胞不能表達目標抗原，因此ICC檢測技術的特異性并不高。

ICC技術最具代表性的應用是由美國Veridex公司(強生子公司)開發的CellSearch系統，但由于CellSearch系統高度依賴所選擇的上皮細胞特異性抗體EpCAM，因此它現階段僅適用于乳腺癌等少數幾種腫瘤細胞的檢測。

免疫細胞化學技術高度依賴所選擇的特異性抗體，可富集的腫瘤細胞種類少，檢測成本高，且回收的腫瘤細胞表面粘滿免疫磁珠，表面形態改變、活性缺失，無法進行后續檢測。

2.差向分離富集技術(Subtraction?Enrichment?Technology,SET)(http://www.cytointelligen.com/technology.html)，其主要作用原理是通過逐步去除血液中絕大多數的血源性白細胞、紅細胞及血漿蛋白的方法，從而達到富集非血源性腫瘤細胞的目的。