[發明專利]F9基因拷貝數變異檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201410322475.2
• 申請日: 2014-07-08
• 公開（公告）號: CN104046699A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 王學鋒;姜正文;丁秋蘭;張希;戴菁;姚忻岑;陸曄玲;林琳
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院;天昊生物醫藥科技（蘇州）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 劉懿

技術領域

本發明涉及生物技術領域，應用于生物科學研究和臨床分子診斷，具體涉及一種F9基因拷貝數變異檢測試劑盒。

背景技術

血友病B（HB）是臨床常見的一種遺傳性出血疾病，主要由F9基因突變導致凝血因子IX（FIX）質或量的缺陷而引起體內凝血功能的異常，在男性中的發病率約為1/30,000。根據血漿中FIX活性，HB可分為輕型（>5%）、中型（1-5%）和重型（<1%）三種類型。重型患者表現為自發性關節出血，肌肉出血和內臟器官出血等，輕型患者表現為外傷后出血難止。因此，該病具有高致殘率和致死率。替代治療是目前唯一有效的治療方法，制劑主要包括凝血酶原復合物（PCC）和重組凝血因子IX（rFIX)。由于缺乏根治措施，通過攜帶者診斷和產前診斷避免血友病胎兒的出生，對提高人口素質，減輕社會負擔具有重要的意義。然而，前提是需要先對家系中血友病B患者進行準確有效的基因診斷。

F9基因位于X染色體長臂27.1-27.2，全長32.7kb，包括8個外顯子和7個內含子及其側翼調控區域。遺傳方式為X連鎖隱性遺傳病，先證者同胞患病風險決定于母親是否為致病基因攜帶者，攜帶者女性的男性后代患病風險為50%，女性后代攜帶致病基因的風險也為50%。男性患者的女性后代100%為攜帶者，而男性后代100%為正常。目前已報道的F9基因突變類型廣泛，包括有點突變、缺失、插入、重復等。隨著基因體外擴增技術的出現和發展，通過患者外周血有核細胞DNA進行F9基因分析已經成為當前進行F9基因診斷的主要手段。簡單來說，針對F9的8個外顯子及其側翼序列區域分別設計PCR引物進行體外擴增，然后將PCR擴增產物進行直接測序，通過將測序結果與參考序列比對，查找可能的致病突變。這種直接測序的方法可以檢測錯義突變、剪接位點突變、無義突變及小缺失和小插入等突變。當家系中先證者的突變位點明確后，對于女性家系成員進行的攜帶者檢測只需擴增相應突變位點所在的外顯子，測序比對是否存在相同的突變。如果該女性為攜帶者，那么相應位點為雜合突變。女性攜帶者懷孕后，為了避免患兒的出生，懷孕16-22周時需要抽取胎兒羊水進行DNA抽提，直接擴增胎兒羊水DNA的相應突變位點所在外顯子，測序比對后查找胎兒是否存在相同的突變。除了直接測序法查找致病突變外，我們還會對家系成員進行基因連鎖分析，以對攜帶者檢測和產前診斷結果進行核實。基因連鎖分析并不是直接檢測致病基因的異常，而是利用與致病基因緊密連鎖和共同傳遞的一系列基因組遺傳多態性標記，通過檢測家系先證者，明確與致病基因相關的這些遺傳標記的特點，進而對家系中其他成員的遺傳標記進行檢測協助診斷。經過前期工作的篩選后，我們選擇了F9?基因外的6個STR位點（DXS1192、DXS1211、DXS8094、DXS8013、DXS1227、DXS102）用于F9基因的遺傳連鎖分析。然而由于遺傳連鎖分析屬于間診斷方法，且容易受到染色體同源重組等因素的影響，不能得到完全可靠的結果，所以需要與常規測序方法的結果相互驗證以取得更加可信的診斷結論。

利用常規直接測序方法可使絕大部分的血友病B家系能得到明確診斷。但據血友病B突變數據庫統計，大缺失或重復突變占總F9基因突變類型的5%左右，直接測序的方法不能給與明確診斷，甚至漏診。首先，當先證者存在大片段缺失時，由于缺失而使得PCR擴增失敗。而對于女性家系成員來說，由于存在另外一條正常的染色體模板，PCR擴增是能夠成功的，測序結果也是正常的，但不能排除攜帶者的可能性。其次，當先證者為大片段重復時，PCR能夠成功擴增所有外顯子區域，但是測序比對不能發現重復突變。此時，對相應外顯子的拷貝數進行定量能夠明確。基因大片段缺失和重復又稱為基因拷貝數變異（CNVs）。隨著微陣列CNV芯片技術以及二代測序技術的發展及應用，發現拷貝數變異（CNVs）廣泛地存在于人類染色體基因組中。CNVs主要由基因組發生重組而導致，一般指長度為幾kb-幾Mb基因組大片段的拷貝數增加或者減少，主要表現為亞顯微水平的重復，缺失和插入等。通過拷貝數檢測方法對先證者F9各外顯子的拷貝數進行檢測，如果相應外顯子缺失，則拷貝數結果為0；如果相應外顯子重復，則拷貝數結果大于1。而對于攜帶者來說，如果缺失拷貝數結果為1，而重復的話拷貝數結果將大于2。但是目前針對CNVs的檢測方法非常多，選擇合適的技術用于F9基因檢測極為重要。