[發明專利]同步檢測蘋果屬上三種檢疫性疫霉的四重PCR引物及其擴增方法

有效

• 申請號: 201410321851.6
• 申請日: 2014-07-08
• 公開（公告）號: CN104046698B
• 公開（公告）日: 2017-02-22
• 發明（設計）人: 張瑩;林宇;郭京澤;胡佳續;廖芳;朱林慧;羅加鳳;劉躍庭;李關榮;黃國明
• 申請（專利權）人: 天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種同步檢測檢疫性真菌病害冬生疫霉P.?hibernalis、丁香疫霉P.?syringae和栗黑水疫霉P.?cambivora的四重PCR引物，引物序列如下：

三種疫霉的通用引物：

18SUF：CGC?GGT?AAT?TCC?AGC?TCC?AAT?A

18SUR：AGA?ACA?TCT?AAG?GGC?ATC?ACA?GAC?C

冬生疫霉的特異引物：

PHSF：CTT?TGC?TCG?AAA?AGC?ATA?ATG?GAA?

PHSR：CCA?CTC?TAC?TTC?ACA?CAA?CAT?CCT

丁香疫霉的特異引物：?

PSSF：AGG?AGG?AAG?GCG?AGA?AGG?CC?

PSSR：GTA?GTA?GAT?GCC?GGG?CTG?CG

栗黑水疫霉的特異引物：

PCSF：CAA?GCT?CCA?GAT?TGT?GCG?TG

PCSR：CGA?ATC?AAA?GCG?GTC?CAA?CC

所述引物用于冬生疫霉和丁香疫霉菌絲基因組DNA擴增，擴增片段為884bp，作為提取和擴增過程的質量控制，?PHSF/PHSR擴增片段為232bp，PSSF/PSSR擴增片段為683bp，PCSF/PCSR擴增片段為314bp，這四套特異引物用于冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的菌絲基因組DNA特異四重PCR擴增。

2.一種權利要求1所述的同步檢測冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物及其擴增方法，其特征在于，包括下述的擴增體系和擴增程序：

（1）擴增體系

建立20μL的擴增體系為，包括10×Buffer?2.0μL（其中含終濃度為1.5mmol/L的MgCl2)；2.5mmol/L?dNTPs?為2.0μL；0.4μLTaq?DNA聚合酶(5U/μL)；濃度為10μmol/L的引物18SUF/18SUR、PCSF/PCSR、PSSF/PSSR和PHSF/PHSR依次為0.2μL/0.2μL、0.6μL/0.6μL、0.8μL/0.8μL、1.0μL/1.0μL；DNA模板1μL（約為20ng)，余量為雙蒸水；

（2）反應程序

設立反應程序：94℃預變性4min；94℃變性30s，63℃復性20s，72℃延伸40s，40個循環；72℃延伸7min。

3.如權利要求1所述同步檢測冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物在檢測冬生疫霉、丁香疫霉、栗黑水疫霉方面的應用。