[發(fā)明專利]一種診斷試劑盒及PPT1基因在其制備中的用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410321626.2
• 申請日: 2014-07-08
• 公開（公告）號(hào): CN104087666B
• 公開（公告）日: 2017-03-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊祚璋;張婭;陳彥錦;劉雪峰;許達(dá)
• 申請（專利權(quán)）人: 楊祚璋
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種骨肉瘤診斷試劑盒及PPT1基因在制備骨肉瘤診斷試劑盒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

骨肉瘤是來源于間葉組織的惡性腫瘤，其主要致病特征為體內(nèi)增殖的腫瘤細(xì)胞直接形成未成熟骨或骨樣組織，是一種人類骨骼系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤。目前，國內(nèi)篩選該疾病的相關(guān)基因主要采用的是基因芯片技術(shù)構(gòu)建表達(dá)譜的方法。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)研究產(chǎn)生了大量的基因芯片數(shù)據(jù)，并通過基因表達(dá)芯片篩選出了影響骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的基因及信號(hào)通路，已鑒別出大量差異表達(dá)的基因。但是不同的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)及樣本的差異導(dǎo)致各個(gè)基因芯片的分析結(jié)果存在很多不一致性。

Meta分析可對同一個(gè)問題所發(fā)表相關(guān)研究報(bào)告的結(jié)果進(jìn)行收集、統(tǒng)計(jì)上的整合，以期獲得更準(zhǔn)確或更多的結(jié)果。這個(gè)分析能產(chǎn)生很多顯著的差異表達(dá)基因，能避免單個(gè)研究帶來的不正確性。Meta分析是在多個(gè)芯片實(shí)驗(yàn)研究中識(shí)別差異表達(dá)基因的強(qiáng)有力工具。此外，用Meta分析能識(shí)別出單個(gè)研究不能識(shí)別的差異基因，并且能有效地降低單個(gè)芯片數(shù)據(jù)的假陽性。

本發(fā)明通過對已發(fā)表的骨肉瘤轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行Meta分析，篩選出影響骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，并使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(QPCR)檢測驗(yàn)證臨床樣本中的表達(dá)，本發(fā)明通過生物信息學(xué)手段發(fā)掘這些基因在骨肉瘤中的作用，從而對骨肉瘤的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行探究，為其診斷和治療提供一定的研究基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明通過對已發(fā)表的骨肉瘤轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行Meta分析和QPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)PPT1基因在骨肉瘤組織中的表達(dá)與在正常組織中的表達(dá)存在差異。與正常組織相比，PPT1基因在骨肉瘤組織中表達(dá)上調(diào)，通過檢測PPT1基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況，可以判斷受試者是否患有骨肉瘤。

本發(fā)明的目的在于提供PPT1基因在制備骨肉瘤診斷試劑盒中的用途。所述診斷試劑盒包含SYBR?Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系、用于擴(kuò)增PPT1基因和管家基因的引物對。SYBR?Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系包含PCR緩沖液、dNTPs、SYBR?Green熒光染料。

上述技術(shù)方案中，PCR緩沖液為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)，優(yōu)選地，PCR緩沖液包含：25mM?KCl，2.5mM?MgCl₂，200mM(NH₄)₂SO₄。

引物對是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)引物設(shè)計(jì)的常規(guī)設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)。優(yōu)選的實(shí)施方案中，擴(kuò)增PPT1基因的正向引物序列為5’-ATGGTGTCAGATGAATATG-3’，反向引物序列為5’-CATGTACTTATTGGCACAA-3’；管家基因優(yōu)選GAPDH，擴(kuò)增該基因的正向引物序列為5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列為5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。

在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體系，該逆轉(zhuǎn)錄體系包含：T重復(fù)寡核苷酸Oligo(dT)、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs。

優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包含：250mM?PH8.3的Tris-HCL，375mM的KCL，15mM的MgCl₂，50mM的DTT。

RNA酶抑制劑可選用本領(lǐng)域常用的RNA酶抑制劑，優(yōu)選為大腸桿菌表達(dá)的非競爭性抑制RNA酶的重組蛋白酶。

在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含RNA提取試劑，RNA酶提取試劑包含Trizol、氯仿、異丙醇、75％乙醇。

本發(fā)明的診斷試劑盒保存于-20℃，盡量減少反復(fù)凍融。

本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種診斷骨肉瘤的試劑盒。所述診斷試劑盒包含SYBR?Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系、用于擴(kuò)增PPT1基因和管家基因的引物對。所述SYBR?Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系包含PCR緩沖液、dNTPs、SYBR?Green熒光染料。

上述技術(shù)方案中，PCR緩沖液為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)，優(yōu)選地，PCR緩沖液包含：25mM?KCl，2.5mM?MgCl₂，200mM(NH₄)₂SO₄。