[發明專利]一種乙酸乙酯的合成方法

在審

• 申請號: 201410320403.4
• 申請日: 2014-07-08
• 公開（公告）號: CN104046660A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 謝定;焦玲;謝易真;文李;方芳
• 申請（專利權）人: 長沙理工大學
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12R1/84
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及有機化學和生物技術領域，特別涉及一種利用基因工程技術催化合成乙酸乙酯（EA）的方法。

背景技術

乙酸乙酯（EA）是一類重要的有機溶劑和有機化工基本原料，廣泛應用于有機合成、醫藥、香料、食品等行業，近年隨著鋰電行業的興起，EA的用量逐漸增大，預計未來幾年國內市場對乙酸乙酯的需求量將保持在10%左右的增長率^[1]。

從生產工藝來看，在國內外市場中，采用乙酸酯化法制備乙酸乙酯的生產能力約占總生產能力的67.5%，我國制備乙酸乙酯主要采取乙酸酯化法；傳統的乙酸酯化法多以硫酸為催化劑，但硫酸對設備腐蝕嚴重，其強氧化性易引發副反應，產品分離提純工序多，難度大，溫度高，耗能高；因此，近些年有許多努力嘗試從不同的方向來克服這些缺陷^[2]；如葛清秀等^[3]研究采用堿性脂肪酶來催化合成乙酸乙酯，該研究雖避免了使用強酸為催化劑，在36℃的溫度下即可合成乙酸乙酯，但所用酶難以重復使用，反應時間較長需48小時，產率低于80%，且所用正庚烷沸點為98.5℃，在與乙酸乙酯分離時還需較高溫度，耗能較大。

而展示酶的酵母菌細胞具有固定化酶可重復使用的優點，又具有制備簡單，可高密度培養獲得大量菌體，成本較低的特點，因而自上世紀末問世以來，發展迅猛，已有許多種蛋白或酶被成功表達的報道，該技術關鍵在于能否構建展示在酵母表面具所需活性蛋白或多肽且能擴增生產的基因工程菌，目前除本發明人外尚未見酵母展示稻米脂肪酶及其應用的報道，未見酵母展示脂肪酶特別是稻米脂肪酶催化合成乙酸乙酯的研究報道。

參考文獻：

[1]王超，候濤.一種乙酸乙酯脫水除雜方法：中國，201010598729.5[P].2010-12-21

[2]韋毅，黃科林，王桂英，彭小玉.乙酸乙酯合成的研究進展[J].大眾科技，2013,15（6）：104-106.

[3]葛清秀，陳建平，黃祖新，柳榮金，孫斌.堿性脂肪酶在正庚烷中催化合成乙酸乙酯的研究[J].食品工業科技，2006，（2）：156-158。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是乙酸乙酯傳統酯化工藝中強酸催化劑對設備腐蝕嚴重、高溫分餾產物能耗高，而普通脂肪酶催化合成乙酸乙酯時間長、產率低、難重復利用的問題。

本發明采取的技術方案是：將序列為SEQ?NO1的稻米脂肪酶基因展示在畢赤酵母表面構建具有酶活力的基因工程菌，通過該基因工程菌的擴增培養使稻米脂肪酶產量大幅增加，將該展示了稻米脂肪酶的基因工程菌加入乙酸、乙醇、沸點在45~60℃的有機溶劑混合體系中，于30~45℃進行催化合成反應，期間間歇靜置分層或用除水劑除去下層的水液，上層經45~60℃加熱回收有機溶劑，即得乙酸乙酯。

具體而言，以重量計在100份乙酸與乙醇混合體系（W/W=1.7~1.4）中，加入50~100份的沸點在45~60℃之間如丙酮或正己烷類有機溶劑、2~6份表面展示有稻米脂肪酶的酵母菌菌體（濕重），于30~45℃進行催化合成反應1~8?h后，定時靜置分層或用2~10份重3A分子篩除去下層的水液，于45~60℃回收有機溶劑后得到乙酸乙酯。

本發明與現有技術相比，反應時間短，轉化率高，1~6?h乙酸乙酯轉化率即可達93%以上，反應后分離所得基因工程菌通過沖洗過濾后可重復用來催化合成反應，重復使用6次后，其單位時間內乙酸轉化成乙酸乙酯轉化率[=（反應前NaOH滴定算出的乙酸mol數-反應后NaOH滴定算出的乙酸mol數）/反應時間]仍可達83%以上，因而綠色、節能、環保，大幅降低了生產成本。

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具體實施方式

以下通過具體實施例對本發明作進一步具體詳細描述，但本發明的實施方式不限于此，對于未特別注明的工藝參數，可參照常規技術進行。

實施例1?、畢赤酵母展示稻米脂肪酶

1、Rlipase基因合成委托生物公司（本例由南京金斯瑞生物科技有限公司）完成，基因克隆在pUC57載體上（pUC57-Rlipase），DNA序列如SEQ1所示。

2、??Rlipase亞克隆到pPIC9K載體中

分別將pUC57-Rlipase和pPIC9K載體進行Eco?RI和Not?I雙酶切，?酶切反應體系分別如下：

pUC57-Rlipase質粒?????????????????34?ml

10*?buffer????????????????????????????????4?ml