[發明專利]用于熒光原位雜交檢測糞腸球菌和/或其他腸球菌的肽核酸探針組及其試劑盒、使用方法、用途

有效

• 申請號: 201410319903.6
• 申請日: 2014-07-07
• 公開（公告）號: CN104032033A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發明（設計）人: 秦勇;何素莉;祝茂生;張麗
• 申請（專利權）人: 玉峰惠仁生物醫藥科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 蘇州華博知識產權代理有限公司 32232
• 代理人: 何蔚

技術領域

本發明涉及臨床關聯微生物的檢測領域，具體涉及檢測糞腸球菌和/或其他腸球菌的肽核酸探針組。

背景技術

腸球菌(Enterococcus)為革蘭陽性，成雙或短鏈狀排列的球菌、卵圓形，無芽胞，無莢膜，部分腸球菌有稀疏鞭毛。營養要求高，需氧及兼性厭氧菌，最適生長溫度35℃。

臨床上常見的是糞腸球菌(Enterococcus?faecalis)和屎腸球菌(Enterococcus?faecium)，是目前醫院內感染的最重要的病原菌之一，少數可分離到鳥腸球菌(Enterococcus?avium)、堅忍腸球菌(Enterococcus?durans)、鉛黃腸球菌(Enterococcus?casseliflavus)等。

腸球菌屬為人類腸道正常菌群，在外界環境中亦存在。該類菌可致院內感染，也可致院外感染，尤其是頭孢菌素類等的應用、留置導尿、血液及腹膜透析等均為導致腸球菌院內感染的危險因素。尿路感染為腸球菌引起的感染中最為常見，多表現為上、下尿路感染，少數為前列腺炎和腎外周膿腫；心內膜炎感染中腸球菌引起的約占5～15％；腸球菌可與大腸桿菌和脆弱桿菌共同感染腹腔、盆腔，極少數情況單獨感染腹腔和盆腔；其他少數情況下腸球菌可致傷口感染、蜂窩織炎、腦膜炎，極少致呼吸道感染。腸球菌引起的心內膜炎、尿路、腹腔、盆腔感染、燒傷后傷口感染等均可成為敗血癥。敗血癥為醫院重癥監護室常見細菌性感染重癥，致死率極高。

腸球菌的耐藥性分為天然耐藥和獲得性耐藥。對于一般劑量或中劑量氨基糖苷類耐藥和對萬古霉素低度耐藥常是先天性耐藥，耐藥基因存在于染色體。近年來獲得性耐藥株不斷增多，表現為對氨基糖苷類高水平耐藥和對萬古霉素、肽可霉素高度耐藥。目前，腸球菌的耐藥問題包括：(1)耐青霉素和氨芐西林的腸球菌。氨芐西林和青霉素的敏感性可用來預測對阿莫西林、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林和哌拉西林/他唑巴坦的敏感性。(2)氨基糖苷類高水平耐藥(HLAR)的腸球菌。臨床微生物實驗室一般應用大劑量的慶大霉素和鏈霉素篩選，其他氨基糖苷類不需進行測試，因為它們對腸球菌的活性并不優于慶大霉素和鏈霉素，敏感結果預示氨芐西林、青霉素或萬古霉素與這種氨基糖苷類抗生素具有協同作用，耐藥結果(HLAR)則預示它們之間不存在協同作用。(3)耐萬古霉素的腸球菌(VRE)。1988年首次報道出現VRE，目前國內三級甲等以上醫院VRE已占分離腸球菌的1％～5％。腸球菌對萬古霉素的耐藥可分為低水平耐藥(MIC為8～32mg/L)和高水平耐藥(MIC≥64mg/L)。

肽核酸(peptide?nucleic?acids，PNA)是1991年由丹麥科學家Nielsen等人設計的一種以中性酰胺鍵為骨架的全新的DNA模擬物，其骨架結構單元為(2-氨乙基)甘氨酸，堿基部分通過亞甲基羰基連接于主骨架的氨基N上，可以序列特異地與DNA、RNA結合。其骨架為電中性，與DNA-DNA或RNA-DNA互補鏈相比，PNA-DNA和PNA-RNA互補不存在靜電排斥作用，因此具有很高的DNA或RNA親和性，在無錯配的情況下其結合具有高穩定性，且雜交速度快，具有良好的細胞穿透性，是核酸探針的良好選擇。

現有的腸球菌檢測方法都需要對細菌DNA進行提取，然后再進行PCR擴增，或者對菌液進行擴增，再以擴增產物進行檢測，費時費工，步驟繁瑣，并且假陽性高，容易造成錯判。

發明內容

本發明的目的是提供一種不需要提取DNA，不需要PCR擴增即可檢測糞腸球菌和/或其他腸球菌的肽核酸探針組及其試劑盒、方法，高效快捷，假陽性低。

為達到上述目的，本發明的技術方案是：用于熒光原位雜交檢測糞腸球菌和/或其他腸球菌的肽核酸探針組，其特征在于：該肽核酸探針組的DNA序列如SEQ?NO：1、SEQ?NO：2所示；

其中，所述SEQ?NO：1序列是：5’-TTA?TCC?CCC?TCT?GAT?GGG-3’，用于檢測糞腸球菌；

其中，所述SEQ?NO：2序列是：5’-TAC?TGA?TCG?GCA?GCT-3’，用于檢測其他腸球菌；

其中，所述SEQ?NO：1序列和SEQ?NO：2序列可分別使用，用來分別檢測糞腸球菌或其他腸球菌，也可同時使用，用來同時檢測糞腸球菌和其他腸球菌。

所述肽核酸探針組能在糞腸球菌和/或其他腸球菌的rRNA、rDNA或互補的rRNA序列中檢測靶序列。