[發明專利]腸桿菌Z0206細菌多糖的制備方法及應用

在審

• 申請號: 201410318539.1
• 申請日: 2014-07-06
• 公開（公告）號: CN104046664A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 汪以真;靳明亮;徐春蘭;羊雪芹
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;A23L1/29;A23L1/30;C12R1/10
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明涉及一種高產細菌多糖菌株，及利用該菌株發酵生產多糖的方法和多糖的應用，它屬于生物工程技術領域。

背景技術

多糖在自然界分布很廣，在高等植物、動物、微生物體內均有存在，是自然界含量最豐富的生物聚合物之一。多糖具有多方面的功能，如能量儲存、結構支持、防御功能等。早在上世紀40年代，多糖就開始用作藥物，1951年美國人Reihy?H首次發現微生物擔子菌中的多糖有抑制腫瘤的活性，到了60年代，多糖作為廣泛的免疫促進劑引起人們的極大興趣，開發多糖為保健食品與藥物也倍受關注。已有研究證明飼料中添加活性多糖能顯著提高動物免疫功能，改善動物生長和生產性能，降低動物死亡率。

很多多糖具有免疫增強活性，表現出對宿主免疫的介導和調節作用，通過刺激免疫細胞的成熟、分化和增殖，改善宿主機體平衡，達到恢復和提高宿主細胞對淋巴因子、激素及其他生理因子的反應性。以此為基礎，多糖表現出與免疫力相關的多種活性功能，如抗腫瘤、降血糖、抗衰老、促進肝臟和骨髓細胞的蛋白質和核酸的合成、抗炎及抗輻射作用等。

近年來，我們通過分離、篩選和純化，從肉靈芝中分離得到了一株高產胞外多糖的細菌菌株陰溝腸桿菌Z0206。所謂肉靈芝，在民間被稱之為“太歲”，據《本草綱目》記載，肉靈芝為本草上品，它是在我國發現的一種天然珍稀物種，即被我國科學界早已認定的一種原生質生命體，確切定名應為“特大型粘菌復合體”。研究表明，菌株陰溝腸桿菌Z0206具有高產多糖的特性，這種細菌多糖以分泌的形式到達胞外，具有產量高、安全、無毒副作用等優點。陰溝腸桿菌Z0206細菌多糖具有一定的抗氧化、抗腫瘤、抗病毒和免疫調節等活性。因此，陰溝腸桿菌Z0206細菌多糖制備在抗氧化和抗腫瘤藥物及添加劑開發和應用上具有重要的意義和廣闊的前景。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種腸桿菌Z0206細菌多糖的制備方法及應用。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種腸桿菌Z0206多糖的制備方法，(1)斜面種子培養：取保藏號為CGMCC?No.2279的腸桿菌Z0206；種腸桿菌Z0206多糖的制備方法：接種到滅菌PDA加富固體培養基上，28-32℃培養36-48h，再次轉接到PDA加富固體培養基上，28-32℃培養36-48h，得到活化菌種；(2)發酵罐培養：將步驟(1)所得到的活化菌種接種至PDA加富液體培養基中進行搖瓶發酵，溫度28-32℃搖床振蕩培養18-20h，得到發酵種子液；發酵罐內加入70％發酵培養基，121℃蒸汽滅菌20min，接種發酵種子液，發酵時間48-72h，得到含有腸桿菌Z0206胞外多糖的發酵液；(3)將步驟(2)所得的發酵液于60-70℃條件下，旋轉蒸發濃縮為原體積的1/10，加入3-5倍體積預冷的95％乙醇，分離取沉淀，依次用無水乙醇、丙酮和無水乙醚洗滌，真空干燥，得到粗多糖粉末；(4)將步驟(3)所得的粗多糖粉末溶解于20倍體積熱的蒸餾水中，用Na₂CO₃調pH至7.0-9.0，加入質量為多糖質量1/40-1/20的胰蛋白酶，55℃水解1-2h后，用草酸調pH至5.0-5.7，加質量為多糖質量1/40-1/20的木瓜蛋白酶，65-70℃水解2-3h后，于100℃水浴加熱5-6min，以終止酶反應；(5)將步驟(4)所得的蛋白酶處理液用草酸調pH值至7.0，加入3％的三氯乙酸，室溫下180-200r/min攪拌1h后，11000rpm離心10-15min，取上清；(6)向步驟(5)所得的清液中加入1/3體積的Sevag試劑，充分振蕩脫去蛋白，制得多糖溶液；(7)將步驟(6)所得的多糖溶液用氨水調pH至8.0，在50℃下滴加20％的H₂O₂，至溶液為淡黃色，保溫2h，然后用稀鹽酸中和PH值至7.0；自來水透析1-2d，蒸餾水透析2-3d后，經真空冷凍干燥得多糖精品。